劉雨珂，徐倩倩，孫佩芳，陳美伊，劉銘峰，段德勇

(湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙 410128)

子宮和卵巢作為雌性生殖系統(tǒng)中重要的器官，其結構會隨生理階段的改變及激素的作用而發(fā)生變化。由于在發(fā)情期犬卵巢大量分泌雌激素和孕激素，使得子宮發(fā)生如子宮內膜和肌層增厚、子宮腺管平均直徑增加等變化[1-3]，這些變化易誘發(fā)犬子宮內膜發(fā)生囊性增生(CEH)，加之子宮頸的開張，易使細菌侵入子宮，引起子宮內膜感染，導致犬子宮蓄膿的發(fā)生[4]。雖已有諸多學者針對犬發(fā)情周期卵巢與子宮組織學結構[5]，誘導發(fā)情后犬生殖器官組織學及組織化學特征[6]，子宮蓄膿犬子宮和卵巢顯微及超微結構[7]，比格犬間情期與發(fā)情期卵巢與子宮組織形態(tài)學觀察[8]，犬子宮蓄膿的組織病理學觀察和微生物分析[9]，犬子宮雌激素受體的免疫組化檢測及其與性激素水平的關系[10]等進行了研究，但上述研究均沒有對比觀察正常發(fā)情期與患子宮蓄膿時犬子宮和卵巢的組織結構變化。

乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)作為非特異性免疫的重要組成部分，不僅存在于乳腺的分泌物中，還廣泛存在于生物體其他的體液和分泌物中，已證實其可在局部與Fe3+相結合而抑制細菌生長、參與局部免疫[11]。國內對LF的功能研究表明，一定劑量的LF可在小鼠腸道內有明顯的抑菌作用[12]；通過慢性鼻竇炎鉤突黏膜中LF表達的研究，證實LF還存在于生物體其他分泌物中，并可參與構建局部免疫防御系統(tǒng)[13]。Esteban等[14]發(fā)現LF具有調節(jié)巨噬細胞活性和刺激淋巴細胞合成的能力；Kolm等[15]發(fā)現LF在馬子宮內膜的表達量會隨發(fā)情周期的變化而改變。但是目前尚未有研究表明LF在正常發(fā)情期和患子宮蓄膿時犬的子宮和卵巢中有表達，并參與局部免疫。鑒于此，本研究對發(fā)情期、乏情期犬的子宮與卵巢、患子宮蓄膿犬的子宮與卵巢，運用組織化學及免疫組織化學方法，對比分析組織結構的變化及乳鐵蛋白的表達情況，擬為犬生殖生理的研究及子宮蓄膿疾病的預防及治療提供形態(tài)學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 所有樣品均由湖南農業(yè)大學動物醫(yī)院經絕育手術采集，其中選取2～3歲健康犬發(fā)情期5例、乏情期5例，6～10歲患子宮蓄膿疾病犬5例。

1.1.2 主要試劑 兔多克隆乳鐵蛋白(Lactoferrin，LF)抗體(11096-RP02)購自北京義翹神州生物技術有限公司；免疫組化SP染色試劑盒(SP-9001)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DAB顯色試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織化學染色法 組織經4%多聚甲醛固定后，梯度酒精逐級脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm。切片經脫水、脫蠟后分別進行Masson’s、VVG、PAS染色，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察并拍照。Masson’s三色(苯胺藍)染色，膠原纖維呈藍色，細胞質和肌纖維呈紅色，核呈灰黑色；VVG染色彈力纖維呈黑色或藍黑色，細胞質和肌纖維呈黃色，膠原纖維呈紅色，核呈灰黑色；PAS染色顯示糖原及其他PAS反應陽性物質均呈陽性，細胞核呈藍色。

1.2.2 免疫組織化學SP法檢測LF的分布 1)5 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；2)在pH6.0且0.01 mol·L-1檸檬酸緩沖液中進行微波抗原修復，高火煮沸5 min后，中火維持8 min，室溫下自然冷卻；3)pH7.4 且0. 01 mol·L-1的PBS內洗滌3次，每次3 min；4)滴加3%過氧化氫溶液，37 ℃下孵育10 min； 5)同步驟3；6)滴加封閉液(SP試劑盒中A液，即10%非免疫性動物血清)，濕盒中37 ℃下孵育15 min；7)滴加一抗(1∶1 000比例稀釋的兔多克隆LF抗體)，濕盒中37 ℃孵育2 h，同時添加1組 陰性對照(用0.01 mol·L-1PBS 代替一抗)；8)同步驟3；9)滴加生物素標記的二抗(SP試劑盒中B液)，37 ℃下孵育15 min；10)同步驟3；11)滴加SP試劑盒中C液(即過氧化物酶標記的鏈霉親和素)，濕盒中37 ℃下孵育15 min；12)同步驟3；13)滴加新鮮配制的DAB 顯色3～10 min；14)自來水沖洗，蘇木精復染、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 發(fā)情周期的確認及子宮蓄膿病的診斷 乏情期與發(fā)情期的劃分以馬文芝[16]對犬發(fā)情周期內臨床生理行為特征的研究為依據，結合犬主描述，初步判定犬的發(fā)情階段。絕育術采集樣本后，制作石蠟切片，并通過與Andersen等[17]和Vermeirsch等[18]對犬卵巢和子宮組織形態(tài)學的研究結果進行比對，最終確定本文采集到的犬子宮和卵巢樣本處于乏情期和發(fā)情期?；甲訉m蓄膿犬子宮和卵巢樣本的采集是通過觀察病犬精神沉郁、腹部腫大、陰道可見膿性分泌物等臨床癥狀；血常規(guī)檢查白細胞、中性粒細胞數增加；B超檢查子宮腔中呈低回聲暗區(qū)，初步確診為子宮蓄膿。通過手術取出子宮后，發(fā)現子宮角膨大，呈暗紅色(圖1)，切開后見大量黏稠膿性內容物，符合子宮蓄膿病理特征。

圖1 患子宮蓄膿犬的子宮和卵巢Fig.1 Uterus and ovary of dog with pyometra

2 結 果

2.1 正常發(fā)情期犬子宮和卵巢組織結構特點

2.1.1 子宮肌層結構特點 乏情期肌束排列緊密，肌束間膠原纖維較少，肌纖維胞核較大，呈橢圓形且位于周邊，胞質紅染(圖2 A、B)；發(fā)情期肌束間隙增大，內縱行肌層肌束間隙顯著增大，且膠原纖維較多，肌纖維胞核較小，呈圓形位于中央，胞質淡粉色(圖2 D、E)。在肌層間的血管層中，乏情期與發(fā)情期子宮血管內彈性膜清楚，呈明顯的波浪狀，外膜中含有豐富的彈性纖維(圖2 C、F)。內膜肌層厚度比(內膜厚度/肌層厚度)在不同時期顯著不同：乏情期和發(fā)情期分別為0.762 0、0.924 3。

A、B. 乏情期子宮肌層；C. 乏情期子宮血管層血管；D、E. 發(fā)情期子宮肌層；F. 發(fā)情期子宮血管層血管；S. 漿膜層；CML. 環(huán)肌層；L. 血管腔；E. 外膜；M. 中膜；A、D. HE染色；B、E. Masson染色；C、F. VVG染色A， B. Myometrium in anestrus; C. Blood vessels of vascular layer of uterus in anestrus; D, E. Myometrium of uterus during estrus; F. Blood vessels of uterine vascular layer during estrus; S. Serosa; CML. Circular muscle layer; L. Lumen; E. Tunica externa; M. Tunica media; A, D. HE staining; B, E. Masson staining; C, F. VVG staining圖2 發(fā)情期和乏情期犬子宮肌層結構Fig.2 Structure of dog myometrium in estrus and anestrus

2.1.2 子宮內膜結構特點 乏情期固有層子宮腺在200×鏡頭下每個視野中的平均數為5～7個；深層腺管數多，且管徑小于淺層腺管；腺上皮細胞為單層高柱狀上皮，胞核呈圓形位于細胞的基底；膠原纖維含量較多，血管四周有少量彈性纖維(圖3 A～C)。發(fā)情期固有層子宮腺每個視野平均數為18～23個；腺管管徑大于乏情期；腺上皮細胞為立方上皮，胞核呈卵圓形或圓形，位于細胞中央；膠原纖維含量少于乏情期，血管周圍無彈性纖維(圖3 E～G)。

PAS染色顯示，子宮腺上皮細胞靠近腺腔處，乏情期、發(fā)情期均有陽性反應，且乏情期陽性反應程度大于發(fā)情期(圖3 D、H)。

A～D. 乏情期子宮固有層；E～H. 發(fā)情期子宮固有層；LP. 固有層；UG. 子宮腺；A、E. HE染色；B、F. Masson染色；C、G. VVG染色；D、H. PAS染色A-D. Lamina propria of uterus in anestrus; E-H. Lamina propria of uterus during estrus; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; A, E. HE staining; B, F. Masson staining; C, G. VVG staining; D, H. PAS staining圖3 發(fā)情期和乏情期犬子宮固有層結構Fig.3 Structure of dog lamina propria in estrus and anestrus

乏情期子宮黏膜上皮為單層柱狀上皮，胞核呈柱狀或圓形位于細胞的中央，胞質染色深，有散在的淋巴細胞；PAS反應集中于黏膜上皮細胞胞質及管腔中陽性分泌顆粒(圖4A、C)。發(fā)情期黏膜上隱窩較乏情期數量多，子宮黏膜上皮細胞內有聚集脂滴，形成泡沫狀上皮細胞，胞核位于細胞頂部且染色深，胞質淡染；PAS反應集中于黏膜上皮細胞基底面和游離面(圖4B、D)。

A、C. 乏情期子宮黏膜；B、D. 發(fā)情期子宮黏膜；EM. 子宮內膜；A、B. HE染色；C、D. PAS染色A, C. Endometrium of anestrus; B, D. Endometrium of estrus; EM. Endometrium; A, B. HE staining; C, D. PAS staining圖4 發(fā)情期和乏情期犬子宮黏膜結構Fig.4 Structure of dog uterine mucosa in estrus and anestrus

2.1.3 卵巢結構特點 乏情期卵巢皮質中原始卵泡數量較多，初級卵泡和次級卵泡較少，有腔卵泡數量少。發(fā)情期卵巢皮質中可見1～2個大黃體，并有成熟卵泡及少量的初級卵泡和次級卵泡(圖5A、D)。卵巢中膠原纖維數量在不同時期顯著不同，發(fā)情期較乏情期多。在PAS反應中，均可在卵泡透明帶處發(fā)現陽性反應，且強度相同(圖5B、E)。在髓質中，乏情期與發(fā)情期卵巢血管內彈性膜清晰，外膜中含有較多彈性纖維(圖5C、F)。

2.2 患子宮蓄膿犬子宮和卵巢結構特點

2.2.1 子宮肌層結構特點 患子宮蓄膿時犬子宮外環(huán)形肌層肌束排列較為緊密，肌層間填充有較多膠原纖維，單個肌纖維體積增大，胞核呈針錐形位于中央，胞核周圍出現空白區(qū)域，呈現腫脹狀態(tài)，胞質淡染(圖6A、B)。子宮血管內彈性膜變薄且有斷裂，外膜中彈性纖維含量減少(圖6C)。內膜肌層厚度比為1.615 0。

2.2.2 子宮內膜結構特點 患子宮蓄膿時犬子宮固有層子宮腺在200×鏡頭下每個視野中的平均數為2～3個；腺管管徑較乏情期和發(fā)情期大，且形狀不規(guī)則，腺腔內有少量巨噬細胞和大量中性粒細胞浸潤；腺上皮細胞發(fā)生空泡變性與胞質增生，細胞邊界不清，在基膜處有散在的淋巴細胞(圖7A)。膠原纖維含量較乏情期和發(fā)情期少，血管周圍無彈性纖維(圖7B、C)。在PAS陽性反應中，子宮腺上皮細胞的陽性反應程度較乏情期弱，比發(fā)情期強(圖7D)。

患子宮蓄膿時犬子宮黏膜為單層柱狀上皮，胞核呈圓形位于細胞基底，細胞發(fā)生空泡樣變性；PAS反應集中于黏膜上皮細胞游離面及胞質內(圖7E、F)。

A, B. 患子宮蓄膿時犬子宮肌層；C. 患子宮蓄膿時犬子宮血管層血管；S. 漿膜層；CML; 環(huán)肌層；A. HE染色；B. Masson染色；C. VVG染色A, B. Myometrium of dog uterus with pyometra; C. Blood vessels of vascular layer of dog uterus with pyometra; S. Serosa; CML. Circular muscle layer; A. HE staining; B. Masson staining; C. VVG staining圖6 患子宮蓄膿時犬子宮肌層結構Fig.6 Myometrial structure of dog uterus with pyometra

2.2.3 卵巢結構特點 患子宮蓄膿時犬卵巢中出現由液體分泌物聚集而成的卵巢囊泡，皮質中可見1～2個大黃體，大量閉鎖卵泡，正常卵泡較少(圖8A)。卵巢中膠原纖維含量較正常發(fā)情期少。在卵泡透明帶處見PAS陽性反應，強度與正常發(fā)情期相同(圖8B)。卵巢血管內彈性膜不連續(xù)，外膜中含有少量彈性纖維(圖8C)。

2.3 LF在正常發(fā)情期犬子宮和卵巢中的表達

2.3.1 LF在子宮中的表達 LF主要在子宮腺上皮細胞、子宮黏膜上皮細胞中有表達(圖9A～D)。在子宮腺上皮細胞中，乏情期LF的陽性表達水平高于發(fā)情期 (P<0.05)；在子宮黏膜上皮細胞中，發(fā)情期LF的陽性表達水平高于乏情期(P<0.05)(表1)。

2.3.2 LF在卵巢中的表達 LF在黃體、卵泡、間質、血管、生殖上皮中均有表達(圖10A～J)，且乏情期LF的陽性表達水平顯著高于發(fā)情期(表2)。LF在生殖上皮中的表達部位在正常發(fā)情期略有不同，表現為乏情期主要集中于生殖上皮細胞核，發(fā)情期主要在生殖上皮胞質內有表達(圖10 E、J)。

2.4 LF在患子宮蓄膿犬子宮和卵巢中的表達

2.4.1 LF在子宮中的表達 LF在中性粒細胞、管腔、子宮腺上皮細胞和黏膜上皮細胞中均有表達(圖11A、B)。在子宮腺上皮中，患子宮蓄膿時LF的陽性表達高于發(fā)情期 (P<0.05)。在子宮黏膜上皮細胞中，患子宮蓄膿時和乏情期表達水平相近(表1)。

A～D. 患子宮蓄膿時犬子宮固有層；E、F. 患子宮蓄膿時犬子宮黏膜；LP. 固有層；UG. 子宮腺；EM. 子宮內膜；A、E. HE染色；B. Masson染色；C. VVG染色；D、F. PAS 染色A-D. Lamina propria of dog uterus with pyometra; E, F. Endometrium of dog with pyometra; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; EM. Endometrium; A, E. HE staining; B. Masson staining; C. VVG staining; D, F. PAS staining圖7 患子宮蓄膿時犬子宮固有層和黏膜結構Fig.7 Structure of the lamina propria and mucous membrane of dog uterus with pyometra

A. 患子宮蓄膿時犬卵巢皮質；B. 患子宮蓄膿時犬卵巢卵泡；C. 患子宮蓄膿時犬卵巢血管；PrF. 原始卵泡；PO. 初級卵泡；CL. 黃體；L. 血管；A. HE染色；B. Masson染色；C. VVG染色A. Ovarian cortex of dog uterus with pyometra; B. Ovarian follicle of dog uterus with pyometra; C. Ovarian blood vessel of dog uterus with pyometra; PrF. Primordial follicle; PO. Primary follicle; CL. Corpus luteum; L. Blood vesse; A. HE staining; B. Masson staining; C. VVG staining圖8 患子宮蓄膿時犬卵巢結構Fig.8 Ovarian structure of dog with pyometra

A. 乏情期子宮固有層；B. 乏情期子宮內膜；C. 發(fā)情期子宮固有層；D. 發(fā)情期子宮內膜；A～D陰性對照分別對應右上角插圖；LP. 固有層；UG. 子宮腺；EM. 黏膜上皮；L. 子宮管腔；MF. 黏膜皺襞A. Lamina propria of uterus in anestrus; B. Endometrium of anestrus; C. Lamina propria of uterus during estrus; D. Estrus endometrium; The negative control is corresponding to the illustration in the upper right corner in A-D; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; EM. Endometrium; L. Uterine lumen; MF. Mucosal fold圖9 發(fā)情期和乏情期犬子宮中LF的表達Fig.9 Expression of LF in the uterus of dog during estrus and anestrus

A～J.LF免疫組化染色，a～j.相應的陰性對照；A～E,a～e.乏情期卵巢；F～J,f～j.發(fā)情期卵巢；A、F.卵巢卵泡；B、G.黃體；C、H.髓質；D、I.血管；E、J.生殖上皮A-J.LF Immunohistochemical staining, a-j.Corresponding negative control; A-E, a-e.Anestrous ovary; F-J, f-j.Estrous ovary; A, F.Ovarian follicle; B, G.Corpus luteum; C, H.Medulla; D, I.Blood vessel; E, J.Germinal epithelium 圖10 發(fā)情期和乏情期犬卵巢中LF的表達Fig.10 Expression of LF in the ovary of dog during estrus and anestrus

A. 患子宮蓄膿時犬子宮固有層; B. 患子宮蓄膿時犬子宮內膜; 陰性對照分別對應右上角插圖；LP. 固有層; UG. 子宮腺; EM. 黏膜上皮; L. 子宮管腔; MF. 黏膜皺襞A. Lamina propria of dog uterus with pyometra; B. Endometrium of dog with pyometra; The negative control is corresponding to the illustration in the upper right corner; LP. Lamina propria; UG. Uterine gland; EM. Endometrium; L. Uterine lumen; MF. Mucosal fold圖11 患子宮蓄膿時犬子宮中LF的表達Fig.11 Expression of LF in dog uterus with pyometra

2.4.2 LF在卵巢中的表達 LF在黃體、卵泡、間質、血管、生殖上皮中均有表達(圖12 A～F)，且患子宮蓄膿時的陽性表達量顯著低于乏情期，但高于發(fā)情期(表2)。生殖上皮中LF的表達部位主要集中于生殖上皮胞質基底部。

表1 正常發(fā)情期及患子宮蓄膿時犬子宮組織中LF的平均光密度值

表2 正常發(fā)情期及患子宮蓄膿時犬卵巢組織中LF的平均光密度值

3 討 論

雌激素和孕酮是重要的生殖激素。在發(fā)情前期、發(fā)情期卵泡發(fā)育過程中，卵泡顆粒細胞會分泌并釋放雌激素，子宮及生殖道在雌激素的作用下發(fā)生充血、黏膜層增厚、黏膜上皮增生、管狀腺體長度增加、分泌增強等生理反應。當成熟卵泡破裂排卵后，卵泡顆粒細胞分化成粒性黃體細胞，形成黃體并分泌孕酮。正常情況下，孕酮可以促進子宮內膜層增生增厚，減弱子宮平滑肌層的運動，抑制子宮內局部免疫作用。本研究發(fā)現，患子宮蓄膿時犬卵巢出現持久黃體，這與Bostedt等[19]研究結果相同。而持久黃體使得卵巢不斷分泌孕酮，從而使血清中孕酮濃度持續(xù)升高，高濃度孕酮將抑制抗原遞呈細胞的成熟，降低白細胞抵抗細菌感染的能力[20]，加之雌激素使子宮頸開放、子宮內膜增生、子宮腺分泌增加，最終使子宮腺體囊性增生，為病原菌的侵入及繁殖創(chuàng)造了條件。

由于子宮腺分泌細胞能合成糖原、中性黏多糖、酸性黏多糖及脂類等物質[27]，利用PAS反應可觀察到腺細胞的分泌活動。本研究通過此方法對犬正常發(fā)情期與患子宮蓄膿時糖原在子宮和卵巢中的分布進行了觀察，發(fā)現在子宮黏膜上皮細胞中，發(fā)情期黏膜上皮細胞的游離面和基底面均有PAS陽性反應，這與Gregoraszczuk等[28]研究結果相似。在子宮固有層中，乏情期腺上皮細胞游離面可見PAS強陽性反應，發(fā)情期中只有少量PAS陽性反應，這與Stroband等[29]對雌性周期和早期妊娠期間豬子宮上皮的PAS觀察結果相似。當犬患有子宮蓄膿時，糖原不規(guī)律的分布在細胞游離緣，這可能是由于炎性產物對上皮細胞結構的破壞，導致糖原分泌下降及無規(guī)律的分布[30]。正常發(fā)情期和患子宮蓄膿時犬卵巢PAS反應在透明帶處均呈陽性且強度相同，說明透明帶在上述情況下分泌和合成糖原的程度相同。

LF是一種具有多種生理活性的天然蛋白質，不僅是乳腺組織分泌的非特異性保護蛋白質，還存在于如淚、汗、唾液、膽汁、胰液、小腸腺液等外分泌物中[10]。LF具有廣譜的抗菌活性[31]，同時還具有調節(jié)巨噬細胞活性和刺激淋巴細胞合成的能力，對抗體生成、T細胞成熟、淋巴細胞中自然殺傷細胞比例均具有調節(jié)作用[14]。本研究發(fā)現，LF在子宮腺上皮細胞、子宮黏膜上皮細胞和患子宮蓄膿時的中性粒細胞，以及在卵巢黃體、卵泡、間質、血管、生殖上皮中均有表達，這與Kolm等[15]的觀察結果相一致。同時，本研究還發(fā)現在子宮黏膜層中，發(fā)情期LF的陽性表達水平高于乏情期，這與Tsumagari等[32]將大腸桿菌接種到出現黃體生成素波前的母犬中，經12 d后并再次恢復的結果相吻合。在發(fā)情期LF陽性表達水平高，且此時發(fā)生子宮蓄膿的概率較小，可能是由于LF在黏膜分泌物中具有較強鐵結合能力和使局部形成相對無鐵狀態(tài)，這有助于黏膜表面的天然免疫反應，從而限制了大多數病原體包括大腸桿菌的入侵和感染[33]。

4 結 論

本研究運用組織學、組織化學及免疫組化技術，對正常發(fā)情期與患子宮蓄膿時犬子宮與卵巢的組織結構及LF的表達情況進行了研究。發(fā)現子宮內膜肌層比在犬患子宮蓄膿時最大，發(fā)情期次之，乏情期最??；從乏情期到發(fā)情期，子宮腺管腔逐步擴大，腺細胞體積縮??；當犬患有子宮蓄膿時，子宮腺腺管管徑進一步擴大，內有中性粒細胞浸潤；LF在子宮腺上皮細胞、子宮黏膜上皮細胞和患子宮蓄膿時的中性粒細胞，以及在卵巢黃體、卵泡、間質、血管、生殖上皮中均有表達。