金剛,張雪,谷曉博,王輝,白雪菲,張眾,蓋昱梓,馬雯*

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 3(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021)4(寧夏葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,寧夏 銀川,750021)

葡萄酒的發(fā)酵主要包括兩個(gè)階段：由酵母參與的酒精發(fā)酵階段和由乳酸菌參與的蘋果酸-乳酸發(fā)酵階段。在自然的條件下,即使不接種酵母和乳酸菌,葡萄上的野生酵母和乳酸菌也能啟動和完成酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵。自然酒精發(fā)酵主要是非釀酒酵母和釀酒酵母將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化為酒精并產(chǎn)生酯類、高級醇和醛類等風(fēng)味物質(zhì)的生物化學(xué)過程[1],接種酒精發(fā)酵則主要是由釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)完成這一轉(zhuǎn)化過程的,酒精發(fā)酵能夠產(chǎn)生大量復(fù)雜的香氣物質(zhì),尤其對果香型葡萄酒的質(zhì)量有重要影響,也給陳釀型葡萄酒提供大量的香氣前體物質(zhì)。自然蘋乳發(fā)酵是酒精發(fā)酵結(jié)束后,在多種乳酸細(xì)菌的作用下將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為L-乳酸,產(chǎn)生雙乙酰、乙偶姻等多種風(fēng)味物質(zhì)的過程,接種蘋乳發(fā)酵則主要由酒酒球菌(Oenococcusoeni)完成這一過程的。蘋乳發(fā)酵能夠改善葡萄酒的口感和香氣,使葡萄酒變得更加圓潤飽滿,提升葡萄酒的感官品質(zhì)[2]。

寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)憑借其獨(dú)特的地理優(yōu)勢,被業(yè)界公認(rèn)為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄和葡萄酒的黃金地帶。赤霞珠(VitisviniferaL.Cabernet Sauvignon)是目前寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的主栽品種,該品種釀制的葡萄酒具有口感醇厚、香氣濃郁的特點(diǎn)。然而,目前產(chǎn)區(qū)的葡萄酒釀造多依賴進(jìn)口的商業(yè)菌株,商業(yè)菌株的廣泛使用使得葡萄酒的同質(zhì)化問題愈加嚴(yán)重,不利于本土特色葡萄酒的發(fā)展。賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)多樣化的葡萄種植區(qū)域蘊(yùn)藏了豐富的釀酒微生物資源,這些野生的釀酒微生物在一定程度上有助于賀蘭山東麓葡萄酒特色和風(fēng)格的體現(xiàn)。有一些研究表明,自然發(fā)酵或使用分離于葡萄漿果、葡萄園和地窖的非釀酒酵母等本土菌株與釀酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵，在復(fù)雜性和感官豐富度上對葡萄酒的感官輪廓發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,有助于改善葡萄酒的香氣、酒體,保護(hù)特定產(chǎn)區(qū)葡萄酒的感官典型性[3-5]。

本研究以賀蘭山東麓青銅峽、紅寺堡和銀川3個(gè)子產(chǎn)區(qū)的赤霞珠為原料,采用自然和接種發(fā)酵,對酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了研究分析,以探索不同子產(chǎn)區(qū)的原料在自然和接種條件下的發(fā)酵對葡萄酒揮發(fā)性化合物種類和含量的影響。研究有助于了解賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)的風(fēng)土特色,為自然發(fā)酵葡萄酒和地域風(fēng)土特色葡萄酒的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料：2017年份寧夏賀蘭山東麓青銅峽、紅寺堡和石嘴山3個(gè)子產(chǎn)區(qū)的赤霞珠葡萄。

試劑：4-甲基-2-戊醇(色譜純),日本TCI公司；NaCl,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890B-7000D)、DB-WAX色譜柱(30 mm×0.25 mm,0.25 μm),美國安捷倫科技有限公司；進(jìn)樣器(PAL RSI 85),瑞士CTC公司；萃取頭CAR/PDMS/DVB(23 Ga,1 cm),美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對采收的葡萄進(jìn)行常規(guī)前處理,在該過程中不添加SO2。酒精發(fā)酵每個(gè)子產(chǎn)區(qū)采用2個(gè)180 L控溫不銹鋼發(fā)酵罐,裝入約130 L除梗破碎后的葡萄醪,溫度控制在25～28 ℃,每隔12 h打一次循環(huán)并測定溫度和比重值。在酒精發(fā)酵結(jié)束采樣后將2個(gè)罐的酒進(jìn)行混合,分裝滿于 20 L不銹鋼發(fā)酵罐中進(jìn)行蘋乳發(fā)酵,溫度設(shè)定為18～20 ℃。其中2個(gè)進(jìn)行自然蘋乳發(fā)酵；另外2個(gè)接種法國諾盟生物科技有限公司的商業(yè)乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵,在此過程中,每隔48 h取一次樣用于蘋果酸-乳酸細(xì)菌的分離和蘋果酸的測定。酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒分別取樣離心后,取上清液封裝放入-20 ℃的冰箱冷凍保存待測定。

1.3.2 揮發(fā)性物質(zhì)測定

(1)樣品前處理

將冷凍在-20 ℃冰箱中的酒樣取出放在裝滿冰塊的盒子中自然解凍。配制內(nèi)標(biāo)：使用12.48 μL 4-甲基-2戊醇,定容到10 mL。解凍完成后,在20 mL頂空瓶中加1.5 g NaCl、5 mL酒樣、10 μL 4-甲基-2-戊醇內(nèi)標(biāo)(2.01 mg/L),密封頂空瓶。

(2)HS-SPME條件

使用1 cm 23 Ga DVB/CAR/PDMS纖維(Supelco),萃取前250 ℃老化10 min。在250 r/min、40 ℃下平衡5 min,然后在40 ℃,250 r/min下萃取30 min后進(jìn)樣,進(jìn)樣口溫度240 ℃,解吸10 min。

(3)GC條件

使用 DB-WAX(30 mm×0.25 mm, 0.25 μm, Agilent)色譜柱,不分流進(jìn)樣,載氣高純氦氣(≥99.999%),起始柱溫40 ℃,恒溫5 min,然后依次以3 ℃/min升到97 ℃,以2 ℃/min升到120 ℃,以3 ℃/min升到150 ℃,以8 ℃/min升到220 ℃,保持10 min。

(4)MS條件

EI電離源：離子源溫度230 ℃,傳輸線溫度240 ℃,轟擊電壓70 eV,掃描范圍40～300 u。

(5)定性與定量分析

通過NIST 2017質(zhì)譜庫,按文獻(xiàn)的保留指數(shù)(retention index,RI)與計(jì)算RI對照定性。將C9-C20烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)樣品加入模擬酒,根據(jù)保留時(shí)間(retention time,RT)和對應(yīng)烷烴的RI來計(jì)算未知香氣物質(zhì)的RI值。計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：RI,計(jì)算化合物保留指數(shù)；n,n個(gè)碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的峰頂保留時(shí)間,min；N,n個(gè)碳原子數(shù)的正構(gòu)烷烴的峰尾保留時(shí)間,min；ti,化合物保留時(shí)間,min；t0,空氣峰,平均流速下的死時(shí)間u=L/t0,min。

選用4-甲基-2-戊醇做內(nèi)標(biāo),對揮發(fā)性成分進(jìn)行相對面積定量分析。計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 2019進(jìn)行基本圖表制作,采用R(3.6.2)統(tǒng)計(jì)分析軟件的agricolae、FactoMineR 和pheatmap程序包分別對揮發(fā)性化合物進(jìn)行顯著性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵及蘋乳發(fā)酵過程控制

酒精發(fā)酵每隔12 h測定溫度和比重值,當(dāng)比重下降到0.992左右時(shí),通過品嘗和殘?zhí)呛康臏y定確定酒精發(fā)酵結(jié)束。蘋乳發(fā)酵開始后,每2～5 d測1次蘋果酸含量的變化,以此來監(jiān)測蘋乳發(fā)酵情況,結(jié)果如圖1所示。3個(gè)子產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵葡萄酒的蘋乳發(fā)酵均能完成,相對于接種蘋乳發(fā)酵,自然蘋乳發(fā)酵的啟動和完成相對緩慢。

Q1-青銅峽自然發(fā)酵葡萄酒；Q2-青銅峽接種發(fā)酵葡萄酒；H1-紅寺堡自然發(fā)酵葡萄酒；H2-紅寺堡接種發(fā)酵葡萄酒；Y1-銀川自然發(fā)酵葡萄酒；Y2-銀川接種發(fā)酵葡萄酒圖1 不同子產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵葡萄酒蘋果酸值含量變化Fig.1 Changes of malic acid during spontaneous and inoculated fermentation in different sub-regions

2.2 自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵對葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

寧夏賀蘭山東麓3個(gè)子產(chǎn)區(qū)自然和接種酒精發(fā)酵的葡萄酒中,共鑒定出42種揮發(fā)性化合物,包括酯類23種,醇類10種,萜烯類2種,醛酮類4種,3種其他揮發(fā)性化合物,僅乳酸異戊酯在紅寺堡赤霞珠酒精發(fā)酵后的葡萄酒中未檢出。與一些采用一種或幾種經(jīng)篩選的酵母[6-7]或乳酸菌[8-9]菌株發(fā)酵對葡萄酒香氣進(jìn)行研究的方式不同,本研究采用的是自然發(fā)酵的方式,并同接種發(fā)酵的葡萄酒進(jìn)行比較。3個(gè)子產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物的含量如圖2所示。

Q-青銅峽產(chǎn)區(qū)；H-紅寺堡產(chǎn)區(qū)；Y-銀川產(chǎn)區(qū)；1-自然發(fā)酵；2-接種發(fā)酵(下同)圖2 青銅峽、紅寺堡和銀川產(chǎn)區(qū)自然和接種酒精發(fā)酵葡萄酒中各種揮發(fā)性化合物的含量Fig.2 Volatile composition of spontaneous and inoculated AF wines in Qingtongxia, Hongsipu and Yinchuan sub-regions注：每個(gè)產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵與接種發(fā)酵之間不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2.1 青銅峽產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵對葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響

青銅峽產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵的葡萄酒中的揮發(fā)性化合物在種類及含量上均以酯類為主,其次是醇類,還含有少量的萜烯類、醛酮類和其他幾類揮發(fā)性化合物。由圖2可知,其他含量較低的揮發(fā)性化合物以及各類揮發(fā)性化合物的總量在自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵的葡萄酒中均無顯著性差異,僅從均值來看,自然酒精發(fā)酵葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物(除醇類外)的含量及它們的總量均高于接種酒精發(fā)酵的葡萄酒,說明該產(chǎn)區(qū)可能存在有利于形成葡萄酒香氣的優(yōu)良酵母。

2.2.2 紅寺堡產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵對葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響

紅寺堡產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵的葡萄酒中,酯類物質(zhì)在數(shù)量上雖然最多,但在含量上以醇類為主,其次是酯類,同樣還含有少量的萜烯類、醛酮類和其他揮發(fā)性化合物。由圖2可知,相對于另外2個(gè)產(chǎn)區(qū),紅寺堡產(chǎn)區(qū)各類揮發(fā)性化合物的含量及它們的總量均較低。可能是因?yàn)榧t寺堡產(chǎn)區(qū)的葡萄所積累的揮發(fā)性物質(zhì)含量較低。

2.2.3 銀川產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵對葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響

銀川產(chǎn)區(qū)與紅寺堡產(chǎn)區(qū)相似,自然酒精發(fā)酵和接種酒精發(fā)酵的葡萄酒的揮發(fā)性成分在含量上以醇類為主,其次是酯類,同樣還含有少量的萜烯類、醛酮類和其他揮發(fā)性化合物。由圖2可知,銀川產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵的葡萄酒中酯類、醇類和其他揮發(fā)性化合物以及它們的總量均低于接種酒精發(fā)酵的葡萄酒,但均無顯著性差異。銀川產(chǎn)區(qū)葡萄酒各類揮發(fā)性化合物及它們的總量僅從均值來看明顯高于另外2個(gè)產(chǎn)區(qū),可能是由于該產(chǎn)區(qū)的葡萄原料積累的揮發(fā)性物質(zhì)較多。

2.3 自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵對葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

蘋乳發(fā)酵一直以來被認(rèn)為是干紅葡萄酒發(fā)酵過程中改善香氣結(jié)構(gòu)的重要發(fā)酵環(huán)節(jié),但也有研究表明這一過程并不能對感官品質(zhì)的改善起到重要作用[10]。本研究中,葡萄酒經(jīng)蘋乳發(fā)酵后,揮發(fā)性化合物的種類基本沒變,僅含量上有所變化,此產(chǎn)區(qū)酒精發(fā)酵的葡萄酒中沒有檢出乳酸異戊酯,可能是由于該物質(zhì)本身含量較低,此產(chǎn)區(qū)葡萄酒揮發(fā)性化合物的含量又總體相對較低,所以未檢出。3個(gè)子產(chǎn)區(qū)自然和接種蘋乳發(fā)酵后葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物的含量如圖3所示。

圖3 青銅峽、紅寺堡和銀川產(chǎn)區(qū)自然和接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒中各種揮發(fā)性化合物的含量Fig.3 Volatile composition in spontaneous and inoculated MLF wines in Qingtongxia, Hongsipu and Yinchuan sub-regions

2.3.1 青銅峽產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵對葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響

青銅峽產(chǎn)區(qū)自然和接種蘋乳發(fā)酵后葡萄酒中揮發(fā)性化合物在數(shù)量和含量上均以酯類為主,醇類次之,還含有少量其他揮發(fā)性化合物。由圖3可知,青銅峽產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒中幾類揮發(fā)性化合物含量及它們的總量均無顯著性差異,但僅從均值來觀察,青銅峽產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵后葡萄酒中的醇類、萜烯類、醛酮類以及各類揮發(fā)性化合物的總量均較接種蘋乳發(fā)酵的葡萄酒高。此外,幾種醇類物質(zhì)中含量最高的苯乙醇在自然蘋乳發(fā)酵葡萄酒中的含量明顯高于接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒,苯乙醇是葡萄酒中一種重要的高級醇[11],它能給葡萄酒帶來玫瑰、花粉和香水香氣。自然蘋乳發(fā)酵葡萄酒中的揮發(fā)性化合物在總量和質(zhì)量上相對接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒更有優(yōu)勢,說明該產(chǎn)區(qū)可能存在利于本土葡萄酒蘋乳發(fā)酵和提高葡萄酒質(zhì)量的優(yōu)良蘋乳發(fā)酵菌株。

2.3.2 紅寺堡產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵對葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響

紅寺堡產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒中揮發(fā)性化合物在含量上以醇類為主,酯類次之,還含有少量其他揮發(fā)性化合物。由圖3可知,紅寺堡產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵的葡萄酒中的酯類(P<0.05)、萜烯類(P<0.01)及揮發(fā)性化合物的總量(P<0.05)均顯著低于接種蘋乳發(fā)酵的葡萄酒。

2.3.3 銀川產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵對葡萄酒中揮發(fā)性化合物的影響

銀川產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵和接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒中揮發(fā)性化合物在含量上以醇類為主,酯類次之,還含有少量其他揮發(fā)性化合物。由圖3可知,僅從均值來觀察,銀川產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物的含量及它們的總量均低于接種蘋乳發(fā)酵的葡萄酒,其中自然蘋乳發(fā)酵的醇類(P<0.05)、萜烯類(P<0.05)和醛酮類(P<0.01)顯著低于接種蘋乳發(fā)酵葡萄酒。

2.4 各子產(chǎn)區(qū)葡萄酒揮發(fā)性成分的研究探討

酯類和醇類物質(zhì)在3個(gè)子產(chǎn)區(qū)葡萄酒中含量相對較高,其次為醛酮類和其他揮發(fā)性化合物。從3個(gè)子產(chǎn)區(qū)揮發(fā)性化合物的總量來看,銀川產(chǎn)區(qū)最高(339.05～453.89 mg/L),其次為青銅峽產(chǎn)區(qū)(202.10～312.80 mg/L),紅寺堡產(chǎn)區(qū)最低(134.00～175.72 mg/L)。銀川產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的醇類總量、醛酮類總量和其他化合物的總量較另外2個(gè)產(chǎn)區(qū)高,青銅峽產(chǎn)區(qū)的酯類總含量較另外2個(gè)產(chǎn)區(qū)高。為了進(jìn)一步探討產(chǎn)區(qū)間2種發(fā)酵方式下2個(gè)發(fā)酵階段葡萄酒揮發(fā)性成分的差異,進(jìn)一步對3個(gè)產(chǎn)區(qū)2種發(fā)酵方式、2個(gè)發(fā)酵階段葡萄酒中的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2.4.1 三個(gè)子產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵前后揮發(fā)性成分主成分分析

分別對青銅峽、紅寺堡和銀川3個(gè)子產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析,分別提取2個(gè)主成分(Dim)。由圖4可知,酒精發(fā)酵后葡萄酒中揮發(fā)性化合物的Dim1和Dim2分別為42.71%和28.80%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為71.51%,蘋乳發(fā)酵后葡萄酒揮發(fā)性化合物的Dim1和Dim2分別為39.50%和29.56%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為69.06%。由葡萄酒個(gè)體因子分布圖可知,3個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄酒可實(shí)現(xiàn)較好的產(chǎn)區(qū)分布。且從揮發(fā)性成分的變量因子圖和葡萄酒的個(gè)體因子圖的分布來看,與蘋乳發(fā)酵前相比,蘋乳發(fā)酵后不同揮發(fā)性成分對不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒的貢獻(xiàn)有所變化。

青銅峽產(chǎn)區(qū)酒精發(fā)酵后的葡萄酒分布在第四象限,位于第四象限內(nèi)的丁酸乙酯、月桂酸乙酯和葵酸乙酯等揮發(fā)性化合物對該產(chǎn)區(qū)葡萄酒香氣的貢獻(xiàn)較其他產(chǎn)區(qū)顯著；紅寺堡產(chǎn)區(qū)酒精發(fā)酵后的葡萄酒分布在第二象限,位于第二象限內(nèi)的苯甲醇、異丁醇和正癸醇對該產(chǎn)區(qū)葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)較其他產(chǎn)區(qū)顯著；銀川產(chǎn)區(qū)酒精發(fā)酵后的葡萄酒主要分布在第一象限,位于第一象限內(nèi)的己酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇等揮發(fā)性成分對該產(chǎn)區(qū)葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)較其他產(chǎn)區(qū)顯著。從酒精發(fā)酵后的主成分分析結(jié)果看,大多數(shù)揮發(fā)性化合物對銀川產(chǎn)區(qū)和青銅峽產(chǎn)區(qū)的香氣貢獻(xiàn)更明顯。蘋乳發(fā)酵結(jié)束后,揮發(fā)性成分的變量因子圖和葡萄酒的個(gè)體因子圖的分布均有所變化,各類揮發(fā)性成分對不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒的貢獻(xiàn)度也產(chǎn)生變化,其中,蘋乳發(fā)酵后對青銅峽產(chǎn)區(qū)葡萄酒貢獻(xiàn)相對顯著的揮發(fā)性化合物數(shù)量明顯增加,青銅峽產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒分布在第一、二象限,位于一、二象限內(nèi)的丁酸乙酯、癸醛和辛酸異戊酯等揮發(fā)性化合物對該產(chǎn)區(qū)葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)較其他產(chǎn)區(qū)顯著；與之相反,蘋乳發(fā)酵后對另外2個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒香氣貢獻(xiàn)較為顯著的揮發(fā)性化合物的數(shù)量明顯減少,紅寺堡產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒香氣分布于第三象限,乙酸己酯對其貢獻(xiàn)較其他產(chǎn)區(qū)顯著；銀川產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒分布在第四象限,位于第四象限內(nèi)的異戊醇、苯乙醇和乙酸苯乙酯等揮發(fā)性化合物對該產(chǎn)區(qū)葡萄酒的香氣貢獻(xiàn)較其他產(chǎn)區(qū)顯著。分析結(jié)果較好地體現(xiàn)了各類揮發(fā)性化合物在蘋乳發(fā)酵前后,在幾個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒中含量的消長變化。

a-酒精發(fā)酵(AF)后變量因子圖;b-AF后個(gè)體因子圖;c-蘋乳發(fā)酵(MLF)后變量因子圖;d-MLF后個(gè)體因子圖1-自然發(fā)酵；2-接種發(fā)酵；cf-重復(fù)圖4 酒精發(fā)酵后及蘋乳發(fā)酵后揮發(fā)性成分變量因子圖及個(gè)體因子圖Fig.4 Variable factor and individual factor graphs of volatile components after alcoholic and malolactic fermentation

2.4.2 三個(gè)子產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵前后揮發(fā)性成分聚類分析

對青銅峽、紅寺堡和銀川3個(gè)子產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分進(jìn)行聚類分析,進(jìn)一步驗(yàn)證3個(gè)子產(chǎn)區(qū)在2種發(fā)酵方式下葡萄酒香氣化合物的變化。實(shí)現(xiàn)不同發(fā)酵階段、不同發(fā)酵方式及不同產(chǎn)區(qū)的聚集。由圖5可知,對葡萄酒中揮發(fā)性成分影響程度由強(qiáng)到弱的因素依次為產(chǎn)區(qū)、發(fā)酵階段、發(fā)酵方式。

揮發(fā)性化合物由上到下被聚為4大類,這4大類化合物在相對含量上的差異較好地實(shí)現(xiàn)了青銅峽、紅寺堡和銀川產(chǎn)區(qū)的分離,整體上,每個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的揮發(fā)性化合物的相對含量相對其他產(chǎn)區(qū)相近。每個(gè)產(chǎn)區(qū)蘋乳發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物相對含量又存在差異,可以較為直觀地實(shí)現(xiàn)蘋乳發(fā)酵前后2個(gè)發(fā)酵階段的分離,其中,青銅峽產(chǎn)區(qū)酒精發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒中第一類以酯類為主的揮發(fā)性化合物的含量相對較高,蘋乳發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒中第二類以醛酮類和酯類為主的化合物含量相對較高；紅寺堡產(chǎn)區(qū)相對于青銅峽產(chǎn)區(qū)和銀川產(chǎn)區(qū)而言,大部分揮發(fā)性化合物的含量均較低,僅酒精發(fā)酵后以醇類為主的第三類化合物在幾個(gè)產(chǎn)區(qū)中含量相對較高；銀川產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中以酯類和醇類為主的第四類化合物的相對含量較高,此類揮發(fā)性化合物又分為兩小類,可以很直觀地觀察到蘋乳發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物在相對含量上的區(qū)別。

圖5 不同產(chǎn)區(qū)2種發(fā)酵方式下蘋乳發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of volatile compounds of wines before and after MLF under two fermentation treatment in three sub-regions注：同一行代表同種物質(zhì)在不同酒樣中的含量,上方的聚類樹根據(jù)不同酒樣各類揮發(fā)性化合物含量的相似度進(jìn)行聚類,揮發(fā)性化合物含量由低到高用從藍(lán)到紅表示

由圖5中各種物質(zhì)顏色深淺變化可以觀察到,3個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄酒蘋乳發(fā)酵結(jié)束后大部分揮發(fā)性化合物的含量降低,也有部分揮發(fā)性化合物的含量升高,其中乳酸乙酯、乳酸異戊酯、丁二酸二乙酯、正辛醇、2, 4-二甲基苯甲醛和2, 4-二叔丁基酚在3個(gè)產(chǎn)區(qū)自然及接種蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒中普遍升高,這與之前一些研究者的研究結(jié)果相符[12],但不同產(chǎn)區(qū)的部分揮發(fā)性化合物的變化會略有不同。例如,除上述物質(zhì)在蘋乳發(fā)酵后上升外,青銅峽產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中辛酸異戊酯和異丁醇的含量在蘋乳發(fā)酵后升高；紅寺堡產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中正己酸乙酯和正己醇在蘋乳發(fā)酵后上升；銀川產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中3-羥基丁酸乙酯、乙酸苯乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、正丁醇、苯甲醇、苯乙醇和香茅醇的含量升高。此外,與銀川產(chǎn)區(qū)和紅寺堡產(chǎn)區(qū)不同,青銅峽自然發(fā)酵的葡萄酒中蘋乳發(fā)酵前后揮發(fā)性化合物的含量大多較對應(yīng)階段接種發(fā)酵葡萄酒中揮發(fā)性化合物含量高?？赡苁怯捎诖嬖诶诋a(chǎn)生更多揮發(fā)性物質(zhì)的本土優(yōu)良菌株。

3 結(jié)論

本研究通過對賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)3個(gè)子產(chǎn)區(qū)自然和接種發(fā)酵的葡萄酒中揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析,從3個(gè)子產(chǎn)區(qū)均鑒定出42種揮發(fā)性化合物,包括酯類23種,醇類10種,萜烯類2種,醛酮類4種,還有3種其他揮發(fā)性化合物,其中,酯類和醇類的含量相對較高。青銅峽子產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵后各類揮發(fā)性化合物的含量(除醇類外)及總量均高于接種酒精發(fā)酵的葡萄酒,自然蘋乳發(fā)酵后各類揮發(fā)性化合物的含量(除酯類外)及總量均較高于種蘋乳發(fā)酵的葡萄酒。紅寺堡子產(chǎn)區(qū)自然發(fā)酵和接種發(fā)酵的葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物在3個(gè)子產(chǎn)區(qū)中的含量均最低,該子產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵后各類揮發(fā)性化合物的含量和總量均較接種酒精發(fā)酵的葡萄酒低,自然蘋乳發(fā)酵后葡萄酒中絕大多數(shù)揮發(fā)性化合物的含量均低于接種蘋乳發(fā)酵的葡萄酒。銀川子產(chǎn)區(qū)葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物的含量是3個(gè)子產(chǎn)區(qū)中含量最高的,該子產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵的葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物及它們的總量均低于接種酒精發(fā)酵的葡萄酒,銀川子產(chǎn)區(qū)自然蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒中各類揮發(fā)性化合物的含量及它們的總量均低于接種蘋乳發(fā)酵的葡萄酒。通過分析蘋乳發(fā)酵后葡萄酒中揮發(fā)性化合物的含量變化,發(fā)現(xiàn)乳酸乙酯、乳酸異戊酯、丁二酸二乙酯、正辛醇、2, 4-二甲基苯甲醛和2, 4-二叔丁基酚在3個(gè)子產(chǎn)區(qū)自然和接種蘋乳發(fā)酵后的葡萄酒中普遍升高,但不同子產(chǎn)區(qū)間的其他揮發(fā)性化合物含量的變化會有所不同。總體來看,青銅峽產(chǎn)區(qū)自然酒精發(fā)酵與自然蘋乳發(fā)酵的葡萄酒中大多數(shù)揮發(fā)性化合物的含量均高于接種發(fā)酵對應(yīng)發(fā)酵階段的葡萄酒,該產(chǎn)區(qū)可能存在可以產(chǎn)生更多揮發(fā)性化合物的本土優(yōu)良菌株。此外,本研究發(fā)現(xiàn)對葡萄酒中揮發(fā)性化合物影響程度從高到低依次為子產(chǎn)區(qū)、發(fā)酵階段和發(fā)酵方式。