顧欣,高濤,劉夢(mèng)雅,叢之慧,張誠(chéng)雅,肖樂艷,李迪,胡景濤

(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,重慶,404000)

多糖在柚皮中易與其他物質(zhì)以化學(xué)鍵的方式相結(jié)合,因此,提取多糖的前提需要破壞該化學(xué)鍵,使多糖游離[6]。目前常用的多糖提取方法有熱水浸提法、酶法、微波法、超聲波提取法等[7]。酶法提取作為多糖提取的主要方法之一,因其具有反應(yīng)條件溫和、提取效率高、產(chǎn)物活性強(qiáng)、成本低、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn),而被廣泛用于植物多糖的提取[8]。

本實(shí)驗(yàn)以梁平柚柚皮為原料,采用復(fù)合酶法提取柚皮多糖。以提取率為指標(biāo),考察液料比、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。并采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定其最佳工藝參數(shù)。此外,采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、紅外光譜、紫外光譜以及掃描電鏡對(duì)其構(gòu)成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。同時(shí),并采用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)考查梁平柚柚皮多糖的抗氧化活性,為梁平柚柚皮多糖的提取及梁平柚綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梁平柚,購(gòu)于重慶市梁平區(qū)；果膠酶、纖維素酶,山東圣斯德食品添加劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),阜陽(yáng)曼林生物技術(shù)有限公司；鄰苯三酚,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸、單糖標(biāo)品,美國(guó)Sigma公司。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器及設(shè)備

UV-2450紫外可見光分光光度計(jì),日本島津公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀,天津港東科技股份有限公司；ALPH1-2/LD-Plus冷凍干燥機(jī),德國(guó)CHRIST公司；I-class UPLC,Xevo TQ-S micro三重四級(jí)桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Waters公司；HITACHI S-3400掃描電鏡,日本日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶法輔助梁平柚柚皮多糖的提取工藝優(yōu)化

1.3.1.1 多糖提取

選取新鮮的梁平柚柚皮于55 ℃條件下烘干,待其干燥至恒重后粉碎并過80目篩。按一定液料比稱取去離子水與柚皮粉末,溶解后加入15 g/L的復(fù)合酶[m(果膠酶)∶m(纖維素酶)=1∶1][9],調(diào)節(jié)pH后,在一定溫度下酶解一定時(shí)間,酶解完成后采用Savag法除去蛋白,再加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行多糖提取,靜置24 h后離心收集沉淀,并經(jīng)冷凍干燥后即得梁平柚柚皮多糖。

1.3.1.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以液料比25∶1 (mL∶g),pH 4,酶解時(shí)間120 min,酶解溫度50 ℃為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件。考察液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL∶g)、pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)、酶解時(shí)間(30、60、90、120、150、180 min)和酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)對(duì)柚皮多糖提取率的影響。

1.3.1.3 響應(yīng)面優(yōu)化

采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法, 以A(液料比)、B(pH)、C(酶解時(shí)間)、D(酶解溫度)為自變量,梁平柚柚皮多糖提取率為響應(yīng)值,優(yōu)化提取的最佳工藝。因素及水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test design

1.3.1.4 多糖提取率的測(cè)定

提取得到的粗多糖樣品放入250 mL容量瓶中,用去離子水定容,并采用苯酚—硫酸法測(cè)定其多糖含量[10]。以葡萄糖為對(duì)照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程：y=0.883 5x+0.025 6,R2=0.991 6。柚皮多糖提取率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：c,多糖溶液的質(zhì)量濃度,mg/mL；m,梁平柚柚皮質(zhì)量,g。

1.3.2 梁平柚柚皮多糖結(jié)構(gòu)表征

1.3.2.1 單糖組成

根據(jù)文獻(xiàn)所描述的方法,采用PMP柱前衍生結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)對(duì)梁平柚柚皮多糖的單糖組成進(jìn)行分析[11-12]。稱取10 mg樣品于20 mL安瓿瓶中,加入5 mL三氟乙酸(2 mol/L)溶液,N2封管后在100 ℃條件下水解2 h。水解完成后,取1 mL水解液并加入1 mL甲醇,于70 ℃條件下用N2吹干,重復(fù)2次后加入1 mL NaOH(0.3 mol/L)溶液溶解殘?jiān)?。分別取400 μL的樣品水解液與單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL試管中,加入400 μL的PMP甲醇溶液,混勻,70 ℃反應(yīng)2 h,反應(yīng)完成后放置至室溫,再加入400 μL的HCl(0.3 mol/L)溶液調(diào)節(jié)pH至6～7,加水1 200 μL,再加入等體積的氯仿萃取,渦旋混勻,靜置后收集水相,重復(fù)2次。將水相用0.45 μm水系濾膜過濾后供UPLC-MS/MS分析。

HPLC條件：Agilent EC-C18色譜柱(2.7 μm, 2.1 mm×50 mm)；流量0.4 mL/min；流動(dòng)相A 20 mmol/L乙酸銨緩沖液(pH 7)；流動(dòng)相B 乙腈；梯度洗脫模式：時(shí)間梯度為0、1、7、11、13、14.5、14.6、17 min,流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)梯度為14%、14%、18.5%、20%、60%、60%、14%、14%。

質(zhì)譜條件：ESI+模式；噴霧電壓2.0 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑溫度500 ℃；脫溶劑氣體N2流速為1 000 L/h；質(zhì)譜掃描范圍m/z170～800。

1.3.2.2 紫外光譜分析

稱取一定量的梁平柚柚皮多糖溶于蒸餾水中,并以蒸餾水為對(duì)照在200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.3.2.3 紅外光譜分析

稱取1～2 mg梁平柚柚皮多糖粉末,置于瑪瑙研缽中,加入150～200 mg干燥后的KBr晶體,研磨均勻后壓片,在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)記錄其紅外光譜。

1.3.2.4 掃描電鏡分析

用導(dǎo)電膠把梁平柚柚皮多糖固定在樣品臺(tái)上,送進(jìn)真空噴鍍儀內(nèi)進(jìn)行噴金處理,隨后在12.5 kV下用掃描電鏡進(jìn)行掃描,拍攝不同倍數(shù)下的外貌形態(tài)。

1.3.3 梁平柚柚皮多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[13]報(bào)道的方法測(cè)定梁平柚柚皮多糖的DPPH自由基的清除能力。稱取0.020 1 g的DPPH,用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶解并定容至250 mL,DPPH溶液和不同濃度的多糖溶液各取2 mL分別混合,靜置30 min,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A1,多糖樣品溶液反應(yīng)后的吸光度值；A2,無水乙醇代替多糖溶液反應(yīng)后的吸光度值；A3,無水乙醇代替DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.3.2 ·OH清除能力的測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)體系模型[14],在2 mL多糖溶液中,按順序加入2 mL 9 mmo1/L的FeSO4溶液、2 mL 9 mmo1/L的水楊酸-乙醇溶液、2 mL 8.8 mmo1/L的H2O2溶液,混勻后37 ℃水浴30 min,在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值, ·OH清除率按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：A1,多糖樣品溶液的吸光度值；A2,蒸餾水代替樣品溶液后的吸光度值；A3,蒸餾水代替H2O2后的吸光度值。

(4)

式中：A1,多糖樣品溶液的吸光度值；A2,蒸餾水代替樣品溶液后的吸光度值；A3,蒸餾水代替鄰苯三酚溶液后的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

如圖1-a所示,液料比在達(dá)到25∶1 (mL∶g)時(shí),多糖的提取率最高;液料比<25∶1 (mL∶g)時(shí),提取率隨著液料比的增加而顯著提高(P<0.05)；液料比>25 (mL∶g)時(shí),提取率隨著液料比的增加而顯著降低(P<0.05)。其原因在于,當(dāng)液料比較低時(shí),溶劑量較少,溶液中的多糖溶解度容易達(dá)到飽和,導(dǎo)致多糖不能完全滲出,從而提取率較低；隨著液料比的增大,多糖的溶出量提高；液料比>25∶1 (mL∶g)時(shí),復(fù)合酶被過度稀釋,對(duì)細(xì)胞壁的破壞作用不完全,導(dǎo)致多糖的溶出量降低。因此選擇液料比為25∶1 (mL∶g)更合適。

a-液料比;b-pH;c-酶解時(shí)間;d-酶解溫度圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experimental注：不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

由于果膠酶和纖維素酶作用的pH范圍分別在3.0～7.0和4.2～5.2,因此選擇pH 4.0～6.5的提取體系進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[16],結(jié)果如圖1-b所示。pH 4.0～5.0時(shí),多糖提取率隨著pH的升高而顯著提高(P<0.05)；pH 5.0～5.5時(shí),雖然多糖提取率隨著pH的升高有提高的趨勢(shì),但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；pH>5.5時(shí),多糖提取率隨著pH的升高而顯著下降(P<0.05)。綜上,pH 5.5左右可以獲得更高的多糖提取率。

酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響如圖1-c所示。酶解時(shí)間<120 min時(shí),多糖提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高(P<0.05)。其原因在于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),果膠酶和纖維素酶對(duì)柚皮細(xì)胞壁的破壞作用更加完全,使得柚皮多糖可以充分溶出。酶解時(shí)間在120 ～150 min時(shí),多糖提取率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著降低(P<0.05)。其原因可能是長(zhǎng)時(shí)間的酶解造成柚皮細(xì)胞中大量細(xì)胞質(zhì)溶出,影響多糖的溶出。酶解時(shí)間>150 min時(shí),酶解時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響趨于平緩(P>0.05)。綜上,選擇酶解時(shí)間120 min更合適。

酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響如圖1-d所示。酶解溫度<50 ℃,多糖提取率隨著酶解升高而顯著提高(P<0.05)。其原因在于隨著酶解溫度的升高,柚皮粉軟化,果膠酶和纖維素酶的活性增強(qiáng),對(duì)柚皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度逐漸加強(qiáng),溶劑分子運(yùn)動(dòng)速度加快,多方面作用下,溶劑與多糖的接觸幾率增加[17]。酶解溫度>50 ℃時(shí),隨著酶解溫度的升高,多糖提取率顯著降低(P<0.05)。其原因在于過高的溫度使得酶的活性降低,導(dǎo)致多糖提取率降低[18]。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。采用Design-expert.8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析,得到回歸方程：Y=4.78+0.44A+0.11B-0.072C+0.79D+0.002 5AB-0.43AC+0.45AD-0.097BC-0.22BD+0.015CD-0.85A2-1.15B2-0.99C2-0.50D2。其中A、B、C、D分別代表液料比、pH值、酶解時(shí)間以及酶解溫度,Y代表多糖提取率。

響應(yīng)面回歸模型的方差分析如表3所示,模型P=0.000 6<0.05,失擬項(xiàng)P=0.168 36>0.05,表明該模型顯著,可以很好地描述測(cè)試結(jié)果。由各因素的F值可知,各因素對(duì)梁平柚柚皮多糖提取率的影響程度由高到低依次為：D(酶解溫度)>A(液料比)>B(pH)>C(時(shí)間)。

表2 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

2.2.2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析及最佳工藝的確定

根據(jù)響應(yīng)面回歸方程,利用Origin 2018軟件繪制各因素響應(yīng)面分析圖和等高線圖(圖2)。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表明兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示交互作用顯著；其次,交互作用的曲面坡度越大,其影響程度越高[19]。如圖2所示,液料比所對(duì)應(yīng)的曲面坡度強(qiáng)于pH,證明液料比對(duì)多糖提取率的影響強(qiáng)于pH。由圖2分析可知，各因素對(duì)多糖提取率的影響強(qiáng)弱依次為：酶解溫度>液料比>pH>酶解時(shí)間,其結(jié)果符合方差分析。

圖2 各因素交互作用對(duì)柚皮多糖提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response and contour diagram of the interactions between factors on the extraction rate of pomelo peel polysaccharide

根據(jù)實(shí)際情況并采用Design-expert.8.0.6軟件確定酶法輔助提取梁平柚柚皮多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)為：液料比25∶1 (mL∶g),pH 6.0,提取時(shí)間90 min,提取溫度50 ℃。程序預(yù)測(cè)此條件下柚皮多糖提取率達(dá)到5.11%。實(shí)際在此條件下獲得的提取率為5.46%,與程序預(yù)測(cè)值相比相對(duì)誤差<5%,優(yōu)化參數(shù)準(zhǔn)確可靠,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 梁平柚柚皮多糖結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 單糖組成分析

利用PMP柱前衍生液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定梁平柚柚皮多糖的單糖組成,其結(jié)果如表4所示。梁平柚柚皮多糖主要由核糖(1.18%)、葡萄糖醛酸(1.32%)、甘露糖(4.26%)、鼠李糖(4.72%)、葡萄糖(11.46%)、半乳糖(21.48%)、半乳糖醛酸(23.67%)和阿拉伯糖(31.90%)組成。

表4 單糖組成結(jié)果Table 4 Results of monosaccharide composition

2.3.2 紫外光譜及紅外光譜分析

圖3 梁平柚柚皮多糖的紫外光譜圖(a)和紅外光譜圖(b)Fig.3 UV(a) and IR(b) spectra of polysaccharide from Liangping pomelo peel

2.3.3 掃描電鏡分析

梁平柚柚皮多糖的掃描電鏡圖如圖4所示,當(dāng)柚皮多糖放大130倍時(shí),多糖為顆粒狀且表面粗糙多孔；當(dāng)放大500倍時(shí)，可看到有光滑的片狀和粗糙的塊狀,許多小顆粒附著在上表面,有纖維狀的結(jié)構(gòu)；當(dāng)放大1 000倍時(shí)可看到梁平柚柚皮多糖呈片狀結(jié)構(gòu),有纖維狀的結(jié)構(gòu)。

a-×130;b-×500;c-×1 000圖4 梁平柚柚皮多糖掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of polysaccharide from Liangping pomelo peel

2.4 梁平柚柚皮多糖的抗氧化活性鑒定

a-DPPH自由基；圖5 梁平柚柚皮多糖抗氧化活性Fig.5 Antioxidative activity of polysaccharide from Liangping pomelo peel

3 討論

復(fù)合酶法常被用于短肽、黃酮、花色苷及多糖等天然活性物質(zhì)的提取[8,32]。在多糖提取研究中,復(fù)合酶法主要被用于植物多糖的提取,通過果膠酶與纖維素酶可水解破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生細(xì)胞局部的坍塌、溶解和疏松,可減少提取時(shí)來自細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)的阻力,從而提高植物多糖提取率[33]。但由于酶活性受到溫度、pH等因素的影響,同時(shí)考慮到多糖提取率易受到液料比、提取時(shí)間等因素的影響,本實(shí)驗(yàn)選擇以液料比、pH、酶解時(shí)間和酶解溫度為自變量,考察其對(duì)梁平柚柚皮多糖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,復(fù)合酶法提取梁平柚柚皮多糖的最佳工藝參數(shù)為：液料比25∶1 (mL∶g)、pH 6.0、酶解時(shí)間90 min、酶解溫度50 ℃。此條件下,多糖提取率為5.46%。郭文等[9]對(duì)柚皮多糖的提取分級(jí)及分子質(zhì)量分布研究中發(fā)現(xiàn),復(fù)合酶法提取蜜柚柚皮多糖的最佳工藝參數(shù)為：酶用量1.5%、料液比1∶25、酶解時(shí)間120 min、酶解溫度50 ℃,提取率為10.39 g/100 g。對(duì)比分析后發(fā)現(xiàn),等比例混合的果膠酶與纖維素酶在柚皮多糖的提取中,其最適液料比和最適酶解溫度可能為1∶25和50 ℃。由于提取方法及提取率計(jì)算方法相同,推測(cè)兩者提取率間的差異可能是受原料差異的影響。另外,由于多糖提取率計(jì)算方法的不同,所以無法與其他研究進(jìn)行對(duì)比。

4 結(jié)論