李海枝,王俊,熊菲菲,劉義鳳,王璽,馬芙俊,段盛林, 周志橋,潘聰,于有強(qiáng),夏凱*,梁愛民

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)2(功能主食創(chuàng)制與慢病營養(yǎng)干預(yù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100015) 3(北京兒童醫(yī)院,北京,100045)4(寧波御坊堂生物科技有限公司,浙江 寧波,315012)

鈣在人體生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用,它是骨骼中主要的礦質(zhì)元素,可參與人體新陳代謝[1-2],且足量的鈣攝入對維持兒童/青少年正常骨密度、達(dá)到高骨量峰值、減少骨折和降低老年骨質(zhì)疏松風(fēng)險至關(guān)重要。膳食營養(yǎng)調(diào)查顯示[3],鈣是一種比較短缺的營養(yǎng)素,即使在正常情況下,膳食中的鈣也只有約30%被人體吸收并沉積到骨骼中?，F(xiàn)階段由于人體中鈣的缺乏,鈣制劑的研究開發(fā)越來越受到人們的關(guān)注與重視。從鈣制劑的發(fā)展歷程看,一般將其分為4個階段：無機(jī)鈣、有機(jī)酸鈣、氨基酸螯合鈣以及肽鈣復(fù)合物[4]。氨基酸螯合鈣和肽鈣復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有優(yōu)良的吸收特性,但相比較肽鈣復(fù)合物,氨基酸螯合鈣生產(chǎn)成本高,且產(chǎn)品質(zhì)量不能保證,因而現(xiàn)階段肽鈣復(fù)合物成為補(bǔ)鈣的優(yōu)選原料[5-6]。

酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide, CPP)是以牛乳酪蛋白為原料,經(jīng)過酶水解、分離純化得到的一種生物活性肽,其特殊的簇磷酸絲氨酸結(jié)構(gòu)具有螯合鈣的能力,是一種良好的礦物質(zhì)載體[7-8]。研究表明CPP可有效阻止Ca2+沉淀,其酪蛋白磷酸肽螯合鈣(CPP-Ca)也可以有效地促進(jìn)人體對Ca2+的吸收利用[9-10]。但CPP以何種形式攝入更穩(wěn)定, CPP與鈣源同時攝入人體后是以何種狀態(tài)存在等問題仍需探究。L-天門冬氨酸螯合鈣(calciumL-aspartate, CaL-ASP)是一種具有生物活性結(jié)構(gòu)的有機(jī)鈣,結(jié)構(gòu)近似于天然的二肽蛋白鈣,一般可通過特異性載體蛋白鈣通道在小腸絨毛膜上皮進(jìn)行主動轉(zhuǎn)運(yùn),且可以螯合物的形式持續(xù)解離出Ca2+供機(jī)體利用,避免了血清中Ca2+濃度過高所致的腎排Ca2+量增加或高鈣血癥[11]。研究發(fā)現(xiàn),CaL-ASP在腸道中可被充分吸收,其吸收率為90%[12]。但是CPP-Ca與CaL-ASP在胃腸道消化的比較少之甚少。

膳食營養(yǎng)成分若想被機(jī)體利用,都要先經(jīng)過胃消化后再被小腸吸收。由于臨床試驗(yàn)以及動物實(shí)驗(yàn)具有復(fù)雜性,因此利用體外消化模型來模擬機(jī)體胃腸道消化,進(jìn)而分析物質(zhì)的抗消化性及結(jié)構(gòu)變化已是食品藥品行業(yè)中比較成熟的方法[13-14]。本文利用CPP制備CPP-Ca,并利用體外消化模型,通過比較對胃腸液的耐受性,確定并對比CPP-Ca、CPP和CaCl2的混合物(CPP+Ca)以及CaL-ASP最終鈣結(jié)合量,以明確消化后含鈣量高、穩(wěn)定性較好的鈣制劑。并且本實(shí)驗(yàn)對消化前后的鈣制劑均進(jìn)行理化性質(zhì)分析,研究其消化前后結(jié)構(gòu)的變化,探究不同鈣制劑經(jīng)胃腸道消化后是否可以維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,為補(bǔ)鈣產(chǎn)品的研發(fā)以及原料選擇提供了技術(shù)支持與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白磷酸肽(CPP, 蛋白質(zhì)≥80%),上海麥克林生化科技有限公司；L-天門冬氨酸鈣(CaL-ASP),上海勵成營養(yǎng)產(chǎn)品科技有限公司；胃液、腸液,美國Sigma化學(xué)公司；CaCl2、KBr,均為分析純,北京化工廠；Tris-HCl緩沖液,碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ICAP6300電感耦合高頻等離子光譜儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司；水浴磁力攪拌器,德國IKA公司；Spectra Max i3酶標(biāo)儀,美國MD公司；EQUINOX 55紅外光譜儀,布魯克光譜儀器公司；Phenom ProX型臺式能譜掃描電鏡,荷蘭Delmic公司；PL203電子精密天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DHG-9145A鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CPP-Ca的制備

稱取5 g CPP,加入250 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.6),按照m(CPP)∶m(CaCl2)=50∶7,加入25 mL 0.25 mol/L CaCl2溶液,混勻。使CPP與CaCl2在40 ℃條件下充分螯合1 h。待螯合完成,4 000 r/min離心10 min,按上清液和無水乙醇體積比1∶6加入無水乙醇醇沉過夜。次日,將樣品4 000 r/min離心10 min后取沉淀,50 ℃將其烘干得CPP-Ca[15-16]。

1.3.2 CPP-Ca中鈣結(jié)合量及螯合物得率的測定

準(zhǔn)確稱取一定量的CPP-Ca干粉,采用HClO4和HNO3混合消化后,電感耦合等離子體(inductively coupled plasma, ICP)測定鈣結(jié)合量,并計(jì)算螯合前后的得率。鈣含量參照GB 5009.268—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體法進(jìn)行檢測。螯合物得率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m1,螯合物質(zhì)量,g；m0,原料中CPP和CaCl2質(zhì)量之和,g。

1.3.3 不同鈣制劑在體外胃腸模擬體系中穩(wěn)定性比較

以CaCl2為對照,比較CaL-ASP、CPP-Ca以及CPP+Ca三種鈣制劑的消化穩(wěn)定性。將干粉配成5 g/L的溶液,用6 mol/L 鹽酸調(diào)pH至2.0,加入2%(體積分?jǐn)?shù))胃液37 ℃水浴中酶解2 h后取出樣品,測定樣品經(jīng)胃液消化后液體中的結(jié)合鈣含量(mg/L)。胃液消化后,繼續(xù)用6 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.6,加入2%(體積分?jǐn)?shù))腸液,37 ℃水浴繼續(xù)酶解,2 h后取出樣品,測定樣品經(jīng)胃腸液共同消化后液體中的結(jié)合鈣含量(mg/L)[17-21]。

1.3.4 不同鈣制劑體外胃腸模擬消化后的結(jié)構(gòu)表征

將胃腸液消化后的樣品以1∶6的體積加入無水乙醇醇沉過夜,于50 ℃條件下將樣品烘干后用于后續(xù)理化性質(zhì)分析。

1.3.4.1 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

應(yīng)用臺式電子掃描顯微鏡對不同鈣制劑及其消化后樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。使用雙層導(dǎo)電膠將樣品粉末固定于電鏡載物臺上,用氮吹系統(tǒng)除去未粘牢的漂浮顆粒,電子顯微鏡使用15 kV的激光電源,放大500倍后獲取圖像[22]。

1.3.4.2 紫外掃描分析

稱取樣品干粉各1 mg溶解于pH 7.6的Tris-HCl中,應(yīng)用酶標(biāo)儀分析紫外光譜圖的變化,設(shè)定掃描波段為230～500 nm。

1.3.4.3 傅里葉紅外光譜分析

稱取樣品干粉各2 mg混入200 mg干燥的KBr粉末,于瑪瑙研缽中研磨均勻,紅外壓片機(jī)壓片后,進(jìn)行紅外光譜掃描,掃描范圍4 000～400 cm-1,掃描64次,分辨率4 cm-1[23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Origin 8.5軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及作圖,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白磷酸肽螯合鈣螯合指標(biāo)分析

按1.3.1制得CPP-Ca,經(jīng)ICP測得鈣結(jié)合量為118.4 mg/g；經(jīng)計(jì)算得率為27.97%。

2.2 不同鈣制劑體外胃腸模擬體系中穩(wěn)定性結(jié)果分析

鈣制劑在被人體吸收利用時需經(jīng)過胃腸道消化后進(jìn)而再被小腸吸收,因此需通過評價其對胃腸液的耐受性來確定鈣制劑的穩(wěn)定性[24]。CaCl2體外模擬消化結(jié)果如圖1所示,經(jīng)胃液消化2 h后,游離鈣含量為87.12%；再經(jīng)腸液消化2 h后,游離鈣含量大幅度下降為52.07%,沉淀鈣含量占總鈣的47.96%。結(jié)果表明,CaCl2在經(jīng)胃液消化后,鈣大部分保持離子狀態(tài),而在胃腸液共同消化作用下,在腸道偏堿性的條件下,有47.96%的鈣會生成沉淀,無法被人體吸收。

圖1 CaCl2在不同條件下各種形式鈣含量的比較Fig.1 Comparison of different forms of calcium content of CaCl2 under different conditions

CPP-Ca體外模擬消化結(jié)果如圖2所示,CPP-Ca經(jīng)胃液消化2 h后,游離鈣占總鈣的74.79%,螯合形式只占25.21%,但再經(jīng)腸液作用下,游離鈣含量下降至總鈣的2.68%,螯合鈣占97.32%；消化過程中未產(chǎn)生沉淀。結(jié)果表明：CPP-Ca在胃部酸性條件下受到破壞,Ca2+主要以游離形式存在；而在偏堿性環(huán)境中,釋放出的Ca2+與CPP螯合,結(jié)合成螯合物,螯合率逐漸恢復(fù),但最終仍會有部分的Ca2+未與多肽螯合,可能是多肽在模擬胃腸消化體系中受到電解質(zhì)環(huán)境以及消化酶的破壞,從而導(dǎo)致了螯合率的下降。

圖2 CPP-Ca在不同條件下各種形式鈣含量的比較Fig.2 Comparison of different forms of calcium content of CPP-Ca under different conditions

CPP與CaCl2按照質(zhì)量比50∶7直接混合進(jìn)行消化。消化結(jié)果如圖3所示,經(jīng)胃液消化后,游離鈣占總鈣的99.07%,再經(jīng)腸液作用后,在偏堿性的腸道環(huán)境中,游離鈣含量下降至54.30%,而剩余鈣皆以螯合鈣形式存在,無沉淀產(chǎn)生。結(jié)果表明,在腸道偏堿性條件下鈣會螯合生成新的CPP-Ca。

圖3 CPP+Ca在不同條件下各種形式鈣含量的比較Fig.3 Comparison of different forms of calcium content of CPP+Ca under different conditions

CaL-ASP體外模擬消化結(jié)果如圖4所示,CaL-ASP經(jīng)胃液消化后,游離鈣占總鈣的98.93%,螯合形式只占2.14%,再經(jīng)腸液消化,此時螯合鈣占99.44%；消化過程中未產(chǎn)生沉淀。結(jié)果表明,CaL-ASP在酸性條件下會將大量Ca2+釋放出來,而在偏堿性環(huán)境中,釋放出的Ca2+會與L-ASP結(jié)合成螯合物形式。

圖4 Ca L-ASP在不同條件下各種形式鈣含量的比較Fig.4 Comparison of different forms of calcium content of Ca L-ASP under different conditions

以上結(jié)果表明,CaCl2雖可釋放大量Ca2+,但在偏堿性環(huán)境中,大部分會產(chǎn)生人體不易吸收的沉淀。對比CPP-Ca與CPP+Ca兩種鈣制劑,經(jīng)胃腸道消化過程中,雖有部分游離鈣存在,但皆無沉淀產(chǎn)生,表明CPP可防止Ca2+沉淀,在堿性環(huán)境中也可結(jié)合生成螯合物形式,但體外螯合的效果優(yōu)于體內(nèi)螯合；而ASPL-Ca在經(jīng)胃腸道消化后螯合鈣占比較大,推測是由于其螯合穩(wěn)定,在胃腸道消化后不會被其他陰離子結(jié)合而損耗。

2.3 不同鈣制劑體外胃腸模擬消化后的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 微觀結(jié)構(gòu)分析

鈣制劑的微觀結(jié)構(gòu)可以了解消化前后其表面形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。圖5為CPP-Ca以及CPP-Ca經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的掃描電鏡圖。CPP-Ca為多孔結(jié)構(gòu),在經(jīng)胃液消化后,復(fù)合物表面形狀不規(guī)則,有孔隙；但經(jīng)腸液消化后,復(fù)合物表面附著小顆粒。

a-CPP-Ca;b-CPP-Ca胃消化;c-CPP-Ca胃腸消化圖5 CPP-Ca以及CPP-Ca胃腸道消化的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrograph of CPP-Ca and CPP-Ca gastrointestinal tract digestion

圖6為CPP、CaCl2以及CPP+Ca腸道消化后鈣制劑的掃描電鏡圖。CPP+Ca是按照CPP-Ca的比例不經(jīng)螯合而直接消化。圖中CPP呈球形,且有小球附著在大球上,而CPP+Ca在酸性條件下,鈣以游離形式存在,無水乙醇無法沉淀。但在腸液消化的堿性環(huán)境中,CPP+Ca掃描電鏡圖呈片狀,表面為不光滑,且有顆粒附著,推測可能是Ca2+被CPP吸附。

a-CPP;b-CaCl2胃消化;c-CPP+Ca胃腸消化圖6 CPP、CaCl2以及CPP+Ca胃腸道消化的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of gastro intestinal digestion of CPP, CaCl2 and CPP + Ca

圖7為CaL-ASP以及CaL-ASP胃腸道消化后鈣制劑的掃描電鏡圖。CaL-ASP是由細(xì)小的棱狀結(jié)構(gòu)體聚集成團(tuán)；在經(jīng)胃液消化后,呈多層花朵式結(jié)構(gòu)；經(jīng)腸液消化后,復(fù)合物呈片狀有顆粒附著。

a-Ca L-ASP;b-Ca L-ASP胃消化;c-Ca L-ASP胃腸消化圖7 Ca L-ASP以及Ca L-ASP胃腸道消化的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron micrograph of gastrointestinal tract digestion of Ca L-ASP and Ca L-ASP

鈣制劑經(jīng)胃腸道消化后,電鏡觀察下的表面結(jié)構(gòu)皆發(fā)生了變化,但是具體的結(jié)合機(jī)制尚不清楚,因此本研究進(jìn)一步利用紫外光譜以及傅里葉紅外光譜對不同鈣制劑胃腸道消化后的特性進(jìn)行分析,明確其結(jié)合機(jī)制。

2.3.2 紫外光譜分析

蛋白質(zhì)、多肽可以通過生色團(tuán)的紫外吸收變化進(jìn)一步推斷出反應(yīng)前后多肽構(gòu)象的變化,因此可以通過紫外光譜推測消化前后物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化[25]。圖8為CPP-Ca胃腸道消化后的紫外光譜,在283 nm處CPP-Ca有極強(qiáng)峰,這是肽鏈中芳香族氨基酸的特征吸收峰,經(jīng)胃液消化后波長為282 nm,但再經(jīng)腸液消化后又紅移至283 nm,吸收強(qiáng)度消化后略微降低,說明CPP-Ca在胃腸道消化過程中有分子或原子相互作用,發(fā)生了電子躍遷和能量級的變化。

圖8 CPP-Ca及其經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的紫外掃描譜圖Fig.8 UV scanning spectrogram of CPP-Ca and its calcium preparation after digestion in gastrointestinal tract

圖9為CPP+Ca消化前后的紫外光譜,消化前后紫外光譜明顯發(fā)生變化。結(jié)合上述體外模擬消化試驗(yàn)結(jié)果推測Ca2+與肽在消化過程中發(fā)生了相互作用,產(chǎn)生新物質(zhì)。CPP+Ca在282 nm處有一個明顯的吸收峰,且經(jīng)消化后,吸收峰的波長和強(qiáng)度皆發(fā)生變化,且強(qiáng)度由0.225增強(qiáng)到0.400,推測CPP可能與Ca2+結(jié)合生成了新的物質(zhì)而導(dǎo)致其吸收峰產(chǎn)生變化。

圖9 CPP+Ca及其經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的紫外掃描譜圖Fig.9 UV scanning spectrum of CPP+Ca and calcium preparation after gastro intestinal digestion

圖10為CaL-ASP消化前后的紫外光譜,消化前后紫外光譜明顯發(fā)生變化。280 nm附近的吸收帶是與芳香族氨基酸殘基的吸光度相對應(yīng),CaL-ASP在284 nm處有特征吸收峰,但經(jīng)消化后,此處的特征峰消失,表明其氨基酸結(jié)構(gòu)被破壞；且其他相對應(yīng)的特征峰皆發(fā)生了紅移,表明在消化過程中CaL-ASP發(fā)生取代作用或是因溶劑效應(yīng)導(dǎo)致其特征峰移動,具體將結(jié)合傅里葉紅外光譜進(jìn)行解析。

圖10 Ca L-ASP及其經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的紫外掃描譜圖Fig.10 UV scanning spectrogram of Ca L-ASP and its calcium preparation after digestion in gastrointestinal tract

2.3.3 傅里葉紅外光譜分析

圖11 CPP-Ca及其經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的紅外掃描譜圖Fig.11 Infrared scanning spectrogram of CPP-Ca and its calcium preparation after digestion in gastrointestinal tract

CPP+Ca的紅外光譜如圖12所示,表明CPP與CaCl2混合經(jīng)胃腸道消化后會引起多肽結(jié)構(gòu)的變化。與CPP+Ca相比,胃腸消化后的CPP+Ca的光譜發(fā)生了明顯變化。3 421.64 cm-1處的伸縮振動吸收峰移動到3 400.42 cm-1,說明在腸液消化的堿性條件下,N—Ca取代了N—H；酰胺I帶的峰消化后由1 629.81 cm-1移動到1 645.24 cm-1,CPP+Ca圖譜官能區(qū)中1 398.36 cm-1處的特征吸收峰為多肽中羧基離子的對稱振動吸收峰,而在消化后此峰移到了1 404.15 cm-1處,說明羧基參與了肽鈣復(fù)合物的形成。此外結(jié)合電鏡、紫外分析,表明CPP+Ca經(jīng)胃腸道消化后會生成新的物質(zhì)即酪蛋白磷酸肽螯合鈣,且發(fā)現(xiàn)氨基和羧基可能是鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。

圖12 CPP+Ca及其經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的紅外掃描譜圖Fig.12 Infrared scanning spectrogram of CPP+Ca and its calcium preparation after digestion in gastrointestinal tract

CaL-ASP經(jīng)胃腸道消化后,紅外圖譜變化較大(圖13),CaL-ASP在3 412.00 cm-1處的波數(shù)不變,說明在消化前后CaL-ASP的N—Ca鍵未發(fā)生變化。

圖13 Ca L-ASP及其經(jīng)胃腸道消化后鈣制劑的紅外掃描譜圖Fig.13 Infrared scanning spectrogram of Ca L-ASP and its calcium preparation after digestion in gastrointestinal tract

但其酰胺-I帶、II帶及III帶的波數(shù)皆發(fā)生了改變。紅外光譜表明,CaL-ASP經(jīng)胃腸道消化,官能團(tuán)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,不能以完整的形態(tài)到達(dá)小腸被人體吸收。

3 結(jié)論

本文首先制備了CPP-Ca,其鈣結(jié)合量為118.4 mg/g。其次,對比了CPP-Ca、CPP和CaCl2以及CaL-ASP的體外胃腸模擬體系中的穩(wěn)定性,通過對鈣結(jié)合量的比較得出,經(jīng)消化后,CaL-ASP的結(jié)合鈣含量最大,占總鈣的99.44%；而CPP-Ca在消化后結(jié)合鈣占總鈣的97.32%；CPP+Ca以混合物的形式進(jìn)行消化后會生成新的肽鈣復(fù)合物,其結(jié)合鈣占總鈣45.7%。結(jié)果表明,鈣制劑進(jìn)入人體后在胃部酸性環(huán)境中結(jié)構(gòu)受到破壞,解離出Ca2+。但是若直接以Ca2+形式進(jìn)入人體后,在腸道環(huán)境中會有接近50%的鈣產(chǎn)生沉淀,無法被人體吸收。而CPP-Ca、CPP和CaCl2以及CaL-ASP雖在酸性條件下受到破壞,但在腸道堿性環(huán)境中再次結(jié)合以螯合物的形式被小腸吸收,并且發(fā)現(xiàn)CPP和CaCl2在人體內(nèi)會螯合生成新物質(zhì)。

如今,隨著對鈣制劑認(rèn)識的不斷深化,氨基酸螯合鈣以及肽鈣復(fù)合物的鈣制劑產(chǎn)品備受消費(fèi)者的青睞。本文對CPP-Ca、CPP和CaCl2以及CaL-ASP三種鈣制劑的抗消化性以及消化前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,為肽鈣復(fù)合物這一新型鈣制劑的開發(fā)與利用提供了技術(shù)參考與理論支持。