羅丹,羅強(qiáng),劉杰,劉志剛

(深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部,廣東 深圳,518000)

醬香型是眾多香型白酒中重要的香型之一,高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵等獨(dú)特的生產(chǎn)工藝使其富含多種生物活性成分[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),醬香型白酒含有有機(jī)酸、酚類化合物、醛類化合物、雜環(huán)類化合物及川芎嗪等多種生物活性成分[3-4]。其中的酚類化合物具有清除自由基、抗氧化、抗衰老的功能[5]；雜環(huán)類化合物——川芎嗪,具有擴(kuò)張血管、抗血栓、抗血小板凝集的生理活性,在缺血性心腦血管疾病的臨床治療中受到廣泛關(guān)注[6]。此外,醬香型白酒中還富含對(duì)人體有益的微量元素[3]。

幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)是一種可引起慢性胃炎的革蘭氏陰性細(xì)菌。調(diào)查發(fā)現(xiàn),發(fā)展中國家有70%以上的人口曾感染過H.pylori,H.pylori感染會(huì)誘發(fā)消化性潰瘍、胃癌等[7]。目前,最常見的H.pylori治療方案多是采用質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPI)和抗生素(阿莫西林、克拉霉素)治療[8],雖有一定的療效,但成功率不盡人意,尚未見的H.pylori根治藥物報(bào)道。

多種醇類化合物具有一定的抗H.pylori活性,有助于抑制H.pylori感染[9]。醬香型白酒中除乙醇外還含有仲丁醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇等多種其他醇類化合物,而關(guān)于這些醇類化合物(active alcohols,AAs)的抗H.pylori活性報(bào)道卻十分缺乏。本文評(píng)價(jià)了醬香型白酒中醇類化合物的抗H.pylori活性,并對(duì)其潛在的機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒 (Moutai-flavor Baijiu (liquor),MTL),貴州茅臺(tái)集團(tuán)；醬香型白酒中生物活性成分 (bio-active compounds in Moutai-flavor Baijiu, BAC),參考文獻(xiàn)[5]的方法提取獲得；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青-鏈霉素 、RPMI 1640,HyClone公司；PBS,廣州瑞舒生物科技有限公司；哥倫比亞瓊脂、布氏肉湯,Oxoid公司；ROS、TNF-α、IL-1β、IL-6等試劑盒,碧云天生物科技有限公司；CCK-8試劑,同仁公司；cagA和vacA抗體,Santa Cruz Biotechnology公司；RNA prep pure Cell/Bacteria Kit,TianGen公司；人胃正常黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞株,ATCC(美國)；H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株為Sydney Strain 1 (SS1)H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株,深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物系惠贈(zèng);其他化合物、標(biāo)準(zhǔn)品均購于阿拉丁試劑有限公司。

低溫高速離心機(jī) (2K15型),Sigma公司；TECAN infinite M200多功能酶標(biāo)儀,德國；三菱C-31厭氧培養(yǎng)盒,日本三菱公司；CytoFLEX流式細(xì)胞儀,美國貝克曼公司;INCO2108型CO2培養(yǎng)箱,德國Memmert；T100 Bio-Rad PCR儀,美國。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外抑菌試驗(yàn)

按文獻(xiàn)方法復(fù)蘇H.pylori并接種于哥倫比亞瓊脂固體培養(yǎng)基,于37 ℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)72 h。然后轉(zhuǎn)移H.pylori至布氏肉湯液體培養(yǎng)基，于37 ℃微需氧振蕩(100 r/min)擴(kuò)大培養(yǎng)。挑起一部分培養(yǎng)72 h的H.pylori菌株,用無菌生理鹽水清洗后,配成布氏肉湯菌懸液；用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁,校正菌液濃度相當(dāng)于1×108CFU/mL[10]。

用PBS作為溶劑溶解BAC、MTL、乙醇及AAs,將培養(yǎng)的H.pylori菌液用PBS重懸至1×107CFU/mL,取0.1 mLH.pylori的PBS混懸液加入配制好的BAC、MTL、Ethanol及AAs溶液中培養(yǎng)72 h,觀察生長情況,H.pylori生長抑制率為50%所對(duì)應(yīng)的濃度即為MIC50。

1.2.2 脲酶法檢測苯乙醇對(duì)H.pylori脲酶活性的影響

在布魯氏肉湯培養(yǎng)基中加入BAC、MTL、乙醇及苯乙醇(AA-29),終質(zhì)量濃度為100 μg/mL,不加藥的肉湯培養(yǎng)基作為H.pylori空白對(duì)照。分別取50 mL培養(yǎng)基并加入1 mL濃度為1×108CFU/mL的H.pylori,37 ℃、微氧環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,4 ℃離心棄上清液,加入3 mL混合蛋白酶抑制劑的PBS,隨后冰浴超聲破碎至澄清,4 ℃下離心,取出上清液置于透析袋中,PBS透析除鹽,得到的脲酶溶液加入等體積的甘油后混合,再加入等體積的50 mmol/L的尿素溶液,室溫孵育20 min后加入根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]中的方法配制的Berthelot顯色液,室溫顯色10 min,酶標(biāo)儀測635 nm的OD值,按照公式(1)計(jì)算脲酶殘余活性:

(1)

1.2.3H.pylori感染對(duì)GES-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響

將GES-1細(xì)胞 (5×103cells/mL,100 μL/well)接種于96或(5×104cells/mL,100 μL/well)接種于6孔板中培養(yǎng)過夜。將H.pylori(1×108CFU/mL)與100 μg/mL的BAC、MTL、乙醇及AA-29在布魯氏肉湯中37 ℃、微氧孵育12 h；隨后分離H.pylori加入到含有GES-1細(xì)胞的96或6孔板中,使H.pylori與GES-1細(xì)胞比例為100∶1,培養(yǎng)箱中孵育12 h后使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性；收集包括上清液漂浮在內(nèi)的全部細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,用預(yù)冷的PBS洗2次,按Annexin V-FITC/PI試劑盒使用說明流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)檢測ROS、TNF-α、IL-1β及IL-6含量。

1.2.4 RT-PCR檢測H.pylori脲酶相關(guān)基因、H.pylori毒力基因轉(zhuǎn)錄

將H.pylori(1×108CFU/mL)與100 μg/mL的BAC、MTL、乙醇及AA-29在布魯氏肉湯中37 ℃振蕩微氧孵育24 h,離心棄上清液,用PBS沖洗3次后,使用RNA prep pure Cell/Bacteria Kit分離總RNA[12]。cDNA的合成按試劑盒(SYBR@PrimeScriptTMRT-PCR Kit)操作說明進(jìn)行,引物如表1所示。

表1 H.pylori脲酶相關(guān)基因Table 1 H.pylori urease related genes

1.2.5 Western blotting檢測

將H.pylori(1×108CFU/mL)與100 μg/mL的BAC、MTL、乙醇及AA-29在布魯氏肉湯中37 ℃振蕩微氧孵育24 h,離心棄上清液,用PBS沖洗3次后,按細(xì)菌蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)菌總蛋白,Western Blotting檢測細(xì)胞毒素基因cagA和空泡毒素基因vacA的蛋白表達(dá)情況[13]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；P<0.05具有顯著性差異,結(jié)果以Mean±SEM表示；對(duì)樣本先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)；方差齊時(shí),用One-Way ANOVA 檢驗(yàn),并進(jìn)行組間的多重比較；方差不齊時(shí),用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),先用 Kruskal-WallisHtest 比較總的差異,再用Mann-Whitney U 進(jìn)行兩組之間比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬香型白酒中醇類化合物對(duì)H.pylori菌落形成的影響

天然產(chǎn)物中含有的多種醇類化合物具有抗菌活性,如從天然產(chǎn)物中分離出的廣藿香醇在體內(nèi)和體外均具有抗H.pylori的作用[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,醬香型白酒中部分醇類化合物具有一定的抑制H.pylori增殖活性。其中二醇及芳香醇類化合物的抗H.pylori增殖活性更佳。AA-29能夠顯著抑制H.pylori增殖,其MIC50低于其他醇類化合物,且優(yōu)于BAC、MTL及乙醇組(表2)。

表2 醬香型白酒中醇類化合物抗H.pylori增殖活性Table 2 Anti H.pylori proliferation activities of alcohols in Maotai-flavor Baijiu

2.2 AA-29抑制H.pylori損傷GSE-1細(xì)胞

研究發(fā)現(xiàn),H.pylori毒力因子會(huì)破壞宿主細(xì)胞線粒體和溶酶體,進(jìn)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞氧化損傷,H.pylori感染誘發(fā)慢性炎癥是導(dǎo)致消化性潰瘍疾病和胃癌的重要因素[14]。為了檢驗(yàn)AA-29能否降低H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷能力,通過CCK8方法檢測了GES-1細(xì)胞的增殖情況結(jié)果如圖1所示。與空白對(duì)照組相比,H.pylori使GES-1細(xì)胞數(shù)目降低22.6%,說明H.pylori感染使細(xì)胞數(shù)目顯著降低,對(duì)其造成了極大的損傷。而AA-29組細(xì)胞數(shù)目比H.pylori高15.6%(P<0.01),說明AA-29處理抑制了H.pylori損傷GES-1細(xì)胞能力。類似的,BAC、MTL及Ethanol預(yù)處理均抑制了H.pylori損傷GES-1細(xì)胞的能力。

1-H.pylori;2-乙醇;3-MTL;4-BAC;5-AA-29圖1 AA-29抑制H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷能力Fig.1 AA-29 inhibits the damage ability of H.pylori to GES-1 cells

研究報(bào)道,H.pylori感染會(huì)損傷胃黏膜細(xì)胞,進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[15]。AA-29處理能夠抑制H.pylori損傷GES-1細(xì)胞能力,我們進(jìn)一步檢測AA-29預(yù)處理能夠抑制H.pylori誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡,結(jié)果如圖2所示。與空白對(duì)照組相比,H.pylori組中GES-1細(xì)胞總凋亡率增加21.4%(P<0.01),說明H.pylori感

圖2 AA-29抑制H.pylori誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡活性Fig.2 AA-29 inhibits H.pylori-induced apoptosis in GES-1 cells

染損傷GES-1細(xì)胞進(jìn)而誘導(dǎo)其凋亡。而AA-29組細(xì)胞凋亡率比H.pylori低14.7%(P<0.01),說明AA-29能夠顯著降低H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷。類似的,BAC、MTL預(yù)處理也降低了H.pylori誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡活性。

H.pylori感染宿主細(xì)胞會(huì)誘發(fā)氧化損傷及炎癥反應(yīng)[15]。因此,檢測了H.pylori感染對(duì)GES-1細(xì)胞ROS及TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子分泌的影響。為便于比較,將空白對(duì)照組中ROS、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量設(shè)為1,其他組含量為相對(duì)值。如圖3所示,H.pylori感染使GES-1細(xì)胞ROS含量增加389%(P<0.01),推測GES-1細(xì)胞數(shù)目下降及細(xì)胞凋亡增加可能是由于H.pylori感染誘發(fā)GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激,進(jìn)而造成氧化損傷導(dǎo)致的。而AA-29顯著降低了H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的氧化損傷能力。相比于H.pylori組,AA-29組ROS含量減少49.5%(P<0.05)；類似的,BAC也顯著降低了H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的氧化損傷能力；而MTL及乙醇組ROS含量與H.pylori組相比則無顯著變化,我們推測,MTL及乙醇未能顯著降低H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的氧化損傷能力。

1-H.pylori;2-乙醇;3-MTL;4-BAC;5-AA-29圖3 AA-29抑制H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的氧化損傷及炎性損傷能力Fig.3 AA-29 inhibits oxidative and inflammatory damage of GES-1 cells induced by H.pylori

進(jìn)一步檢測了AA-29能否抑制H.pylori誘發(fā)GES-1細(xì)胞炎癥的活性。如圖3所示,H.pylori感染使GES-1細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌增加231%(P<0.01)、359%(P<0.01)、410%(P<0.01)；而AA-29顯著抑制H.pylori誘發(fā)GES-1細(xì)胞炎癥的能力。相比于H.pylori組,AA-29組中TNF-α、IL-1β及IL-6分泌降低38.1%(P<0.05)、35.1%(P<0.05)及49.4%(P<0.05)；類似的,BAC也能夠顯著抑制H.pylori損傷GES-1細(xì)胞、誘發(fā)細(xì)胞炎性損傷的能力。而MTL及乙醇組中TNF-α、IL-1β及IL-6含量變化不明顯,推測MTL及乙醇未能顯著抑制H.pylori誘發(fā)GES-1細(xì)胞炎性損傷的能力。

2.3 AA-29抑制H.pylori脲酶活性

H.pylori定植宿主細(xì)胞是H.pylori感染的關(guān)鍵步驟,脲酶是H.pylori定植過程的關(guān)鍵蛋白。脲酶還會(huì)誘發(fā)宿主細(xì)胞炎癥反應(yīng),甚至誘導(dǎo)腫瘤[16]。如圖4所示,相比于空白對(duì)照組,AA-29組H.pylori脲酶活性降低20.4% (P<0.05)；BAC預(yù)處理也顯著降低了H.pylori脲酶活性,相比于H.pylori組,其活性下降14.7% (P<0.05)；而MTL及乙醇預(yù)處理未顯著影響H.pylori脲酶活性。

圖4 AA-29抑制H.pylori脲酶活性Fig.4 AA-29 inhibits H.pylori urease activity注：H.pylori空白對(duì)照組的脲酶活性設(shè)為100%,其他組脲酶活性為相對(duì)值,與H.pylori空白對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.4 AA-29抑制H.pylori毒力基因及脲酶相關(guān)基因的表達(dá)

RT-PCR檢測H.pyloribabA、cagA及vacA基因轉(zhuǎn)錄變化結(jié)果如圖5-a所示。AA-29能夠抑制H.pyloribabA、cagA的轉(zhuǎn)錄,但未顯著抑制vacA轉(zhuǎn)錄。此外,BAC對(duì)babA、cagA及vacA轉(zhuǎn)錄也有較強(qiáng)的抑制能力,且抑制活性高于MTL及乙醇組。babA、cagA及vacA編碼的蛋白能夠誘發(fā)炎癥導(dǎo)致細(xì)胞損傷等,因此,我們推測,AA-29可通過抑制H.pylori相關(guān)毒力基因的表達(dá),減少H.pylori對(duì)GSE-1細(xì)胞的損傷能力。

1-H.pylori;2-乙醇;3-MTL;4-BAC;5-AA-29圖5 AA-29抑制H.pylori毒力基因及脲酶相關(guān)基因的表達(dá)Fig.5 AA-29 inhibits the expression of H.pylori virulence genes and urease related genes

H.pylori脲酶蛋白主要由結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白組成,其中結(jié)構(gòu)蛋白由ureA和ureB基因編碼,構(gòu)成H.pylori的脲酶原；ureE、ureF、ureG、ureH和ureI則編碼了H.pylori的輔助蛋白,能夠?qū)㈡囯x子轉(zhuǎn)運(yùn)到無活性的脲酶原上并激活脲酶蛋白；nixA蛋白則能獨(dú)立的將鎳離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)[19]。

為進(jìn)一步驗(yàn)證AA-29抑制脲酶活性的功能是通過抑制H.pylori基因簇的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)的,我們采用RT-PCR方法檢測H.pylori脲酶的ureA、ureB、ureE、ureH、ureI和nixA基因轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果如圖5-b、5-c所示。AA-29可顯著抑制ureA、ureH和nixA基因轉(zhuǎn)錄,但對(duì)ureB、ureE和ureI基因的轉(zhuǎn)錄無顯著影響；乙醇組僅抑制了ureA和ureH基因轉(zhuǎn)錄；BAC和MTL均抑制了ureA、ureH和nixA的基因表達(dá)。

2.5 AA-29抑制H.pylori毒力蛋白表達(dá)

Western Blotting分析H.pyloricagA、vacA的表達(dá),結(jié)果如圖6所示。AA-29能夠顯著降低H.pylori中cagA的表達(dá),與RT-PCR結(jié)果類似(圖6)。推測AA-29可通過抑制H.pylori中相關(guān)毒力基因的轉(zhuǎn)錄及毒力蛋白表達(dá),從而抑制H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷。

1-H.pylori;2-乙醇;3-MTL;4-BAC;5-AA-29圖6 AA-29抑制H.pylori毒力蛋白cagA和vacA的表達(dá)Fig.6 AA-29 inhibits the expression of H.pylori virulence proteins cagA and vacA

3 討論

胃上皮細(xì)胞是胃腸道黏膜機(jī)械屏障的重要組成部分,其分泌的細(xì)胞因子和趨化因子對(duì)胃腸道黏膜通透性有著重要的影響。H.pylori感染首先是通過表達(dá)babA等外膜蛋白黏附在胃腸道黏膜細(xì)胞上,再通過表達(dá)vacA和cagA等蛋白誘發(fā)炎癥和細(xì)胞損傷,進(jìn)而增加胃腸道黏膜通透性,利于其遷移。定植是H.pylori感染的第一步,H.pylori定植宿主細(xì)胞后會(huì)釋放cagA和vacA等毒力因子誘發(fā)胃上皮細(xì)胞炎癥和氧化損傷等,脲酶則在H.pylori的定植中起到關(guān)鍵性的作用。ureA、ureB、ureE、ureH、ureI和nixA等基因編碼的蛋白在脲酶的形成和活化中至關(guān)重要。

本研究表明,醬香型白酒中的醇類化合物可抑制H.pylori生長；其中,AA-29 (苯乙醇)可通過抑制脲酶結(jié)構(gòu)基因、輔助基因(ureA、ureH、nixA)的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)抑制H.pylori脲酶活性；此外,AA-29還通過抑制H.pylori相關(guān)毒力基因babA及vacA的轉(zhuǎn)錄,及vacA的表達(dá)發(fā)揮其抑制H.pylori對(duì)GES-1細(xì)胞的損傷能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),AA-29可抑制H.pylori對(duì)GES-1的感染及誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷及炎性損傷的能力。

本研究說明醬香型白酒中的部分醇類化合物具有抗H.pylori增殖,減輕H.pylori對(duì)胃黏膜細(xì)胞損傷的活性,但大量研究顯示酗酒會(huì)損傷胃腸道黏膜,醬香型白酒中的生物活性物質(zhì)雖具有抑制H.pylori對(duì)胃黏膜細(xì)胞損傷的活性,但仍不建議酗酒。