唐瓔,鄧展瑞,黃佳,楊曉楠

(甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,甘肅 蘭州,730050)

黃曲霉毒素是一類廣泛分布于自然界且具有極強(qiáng)致畸性、致癌性、生理代謝毒性的真菌毒素,它主要為黃曲霉(Aflatoxinflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)在潮濕適宜的環(huán)境中產(chǎn)生聚酮反應(yīng)生成的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]。黃曲霉毒素性質(zhì)穩(wěn)定,裂解溫度在268 ℃以上,且在酸性及中性條件下穩(wěn)定,在堿性條件(pH 8.5以上)容易分解。目前發(fā)現(xiàn)的18種黃曲霉毒素中,以黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)毒性最強(qiáng),被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)定為1類致癌物[3]。目前普遍應(yīng)用于去除AFB1的方式有物理法、化學(xué)法,但設(shè)備投入成本高,破壞食品或飼料營(yíng)養(yǎng)成分及口感,產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物。生物去除法是目前AFB1脫毒方法的研究熱點(diǎn),其條件溫和、特異性強(qiáng)、安全有效,且副產(chǎn)物毒性小或者無毒。今后生物降解法將逐步取代化學(xué)及物理方法,用于工業(yè)化去除飼料及食品中AFB1污染[4-6]。

生物法去除AFB1主要有降解、吸附、抑制3種模式。生物降解法去除AFB1機(jī)制是微生物代謝產(chǎn)生的酶或其他物質(zhì),破壞AFB1結(jié)構(gòu)中的毒性位點(diǎn),使AFB1難與蛋白、核酸結(jié)合,達(dá)到脫毒的效果[7-10]。國(guó)內(nèi)報(bào)道,以香豆素為唯一碳源,篩選到一株對(duì)AFB1降解率為85.7%的嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonassp.),這是首次分離到能降解AFB1的單胞菌屬菌株[11]。RAKSHARAO等[12]篩選到1株BacilluslicheniformisCFR1,AFB1降解率為93.57%,并通過檢測(cè)降解產(chǎn)物,證明AFB1被降解為不同無熒光反應(yīng)的物質(zhì),且致變性減弱。XIA等[13]通過研究1株枯草芽孢桿菌JSW-1降解機(jī)制,發(fā)現(xiàn)起降解作用的是菌株胞外蛋白或代謝分泌到胞外的酶類。多數(shù)降解AFB1菌株的降解機(jī)制是將AFB1轉(zhuǎn)化為低毒性的AFD1、AFD2和AFD3,例如SAMUEL等[14]分離到1株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。國(guó)內(nèi)目前關(guān)于生物降解AFB1的應(yīng)用研究較少,生物降解AFB1的工業(yè)化應(yīng)用受降解菌株本身、菌株耐受度、降解產(chǎn)物毒性等原因制約,生物降解AFB1代謝過程及終產(chǎn)物研究分析還欠缺,導(dǎo)致目前還未有大規(guī)模應(yīng)用。

本研究團(tuán)隊(duì)從青藏高原極端環(huán)境中,以香豆素為唯一碳源,從易存在黃曲霉毒素降解菌的牦牛糞中篩選到耐受度好,降解率為83.5%,可以在pH 8.5條件下生長(zhǎng)的菌株WTX1,經(jīng)生理生化、核酸測(cè)序鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。提取菌株降解后發(fā)酵液,采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-MS/MS,UPLC-MS/MS)分析降解后副產(chǎn)物結(jié)構(gòu),研究菌株的代謝機(jī)制,初步探究菌株WTX1降解AFB1的終產(chǎn)物。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源

2019年4月～9月采集青藏高原牦牛糞,實(shí)驗(yàn)室前期分離出1株AFB1降解率為83.5%的芽孢桿菌屬菌株WTX1,該菌株4 ℃保藏于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

(1)培養(yǎng)基與試劑。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA(CM168)、胰蛋白胨大豆肉湯TSB(CM301)、革蘭氏染液(CM1001)、葡萄糖生化鑒定試劑盒(M105)、氨基酸脫羧酶系列生化鑒定試劑盒(M005)、磷酸鹽緩沖液(CM1022)、硫化氫生化鑒定試劑盒(M035),北京陸橋技術(shù)公司;革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡(LOT：2421354203),生物梅里埃公司。

(2)基因提取、擴(kuò)增試劑。細(xì)菌核酸提取試劑盒、核酸多重PCR擴(kuò)增試劑盒,北京卓成惠生生物科技公司；核酸染料SYBR Gold,Thermo Fisher Scientific。

(3)質(zhì)譜試劑。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品,以色列 Fermentek；甲醇、二氯甲烷、苯、HCl,均為色譜純(GR),Sigma；乙腈(色譜純GR),Thermo Fisher Scientific；NaCl(分析純AR),科密歐。

1.2 儀器與設(shè)備

VITEK 2 COMPACT 30全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng),生物梅里埃美國(guó)股份有限公司；QTRAP 4500型超高效液相色譜質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS),SCIEX公司；HF 1800 A2生物安全柜、2720型PCR儀、iBright CL750智能成像系統(tǒng),Thermo Fisher Scientific；HF 1200 A2型生化培養(yǎng)箱,BD公司；CHEF Mapper XA脈沖場(chǎng)電泳儀,BIO-RAD公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī),貝克曼庫爾特；PTY-623電子天平,梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株WTX1的鑒定

1.3.1.1 形態(tài)鑒定

將實(shí)驗(yàn)室前期從青藏高原牦牛糞中篩選到降解AFB1率為83.5%的菌株WTX1,在TSA瓊脂平板活化后,30 ℃培養(yǎng)36 ～72 h,觀察菌株WTX1單菌落形態(tài),用顯微鏡油鏡觀察革蘭氏染色、芽孢染色后的菌株。

1.3.1.2 菌株生理生化鑒定

采用微生物全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)及傳統(tǒng)微生物生化鑒定試劑盒,依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15],《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16],對(duì)WTX1菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.3.1.3 16S rRNA分析及系統(tǒng)發(fā)育樹建立

參考唐瓔等[17]的方法,采用細(xì)菌脫氧核酸提取擴(kuò)增試劑盒提取WTX1菌株DNA,采用通用引物27F(5′-AGACTATGATCGTCGCACTG-3′),1541R(5′-AAGGAGGTGTACCTGCC-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA保守序列,由北京卓成惠生生物科技公司提供。PCR反應(yīng)體系見表1[17]：

表1 PCR反應(yīng)體系條件Table 1 PCR reaction system condition

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提交到NCBI庫進(jìn)行BLAST分析,將目標(biāo)序列與搜索到的同源序列在GenBank比對(duì),用MEGA軟件中的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 發(fā)酵液中生物量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[17-18]的方法,取菌株WTX1以107CFU/mL濃度接種于TSB液體培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng),每隔6 h測(cè)定菌株發(fā)酵液生物量(OD600)值,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),發(fā)酵液OD600值為縱坐標(biāo),測(cè)定發(fā)酵液中菌株生物量變化。

1.3.3 菌株WTX1各組分降解機(jī)制研究

參考GOMAA等[19]方法。取50 mL菌株WTX1發(fā)酵液,4 ℃,8 000 r/min離心15 min,分離上清液及菌體。再將菌體用無菌PBS洗滌、離心重復(fù)3次后加入50 mL無菌PBS,制備菌液濃度為107CFU/mL的菌懸液。用上述方法制備得到的菌懸液,低溫超聲破碎15 min后,12 000 r/min離心10 min,收集上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾得到菌株胞內(nèi)液。將菌株上清液、菌懸液、胞內(nèi)液分別加入AFB1-TSB溶液中(100 mL,質(zhì)量濃度10 μg/mL),30 ℃避光孵育24 h后,分別檢測(cè)AFB1降解率。

1.3.4 菌株WTX1降解率檢測(cè)及產(chǎn)物分析

1.3.4.1 菌株降解率檢測(cè)

將純化的WTX1菌株,制備濃度為107CFU/mL菌懸液(PBS,pH 7.4),取50 mL接種于10 μg/mL AFB1-TSB培養(yǎng)液中,30 ℃液態(tài)發(fā)酵,避光發(fā)酵72 h后,離心收集上清液(12 000 r/min,15 min,4 ℃)。取1 mL上清液,用等體積二氯甲烷渦旋振蕩萃取3次,萃取液在55 ℃條件下氮吹干燥。用1 mL甲醇(GR)溶解沉淀,0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾,渦旋混勻進(jìn)樣。用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)上清液中殘留的AFB1含量,測(cè)量菌株AFB1降解率。按公式[17,20](1)計(jì)算：

(1)

式中：S,AFB1降解率,%；C,接種菌株發(fā)酵后樣品中殘留AFB1的峰面積；F,對(duì)照樣品AFB1的峰面積。

1.3.4.2 菌株WTX1降解產(chǎn)物分析

參考李文明[21]的方法。取30 ℃避光發(fā)酵36 h菌株WTX1發(fā)酵液,離心(8 000 r/min,15 min,4 ℃)分離上清液。上清液樣品前處理同1.3.4.1中步驟。采用UPLC-MS/MS方法得到發(fā)酵上清液總離子流圖,再將總離子流圖中峰值頂點(diǎn)的質(zhì)譜圖導(dǎo)入NTST MS search 2.2軟件,查詢菌株WTX1降解AFB1的終產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu),分析菌株的代謝過程,用AFB1-TSB標(biāo)準(zhǔn)溶液作對(duì)照。

1.3.4.3 UPLC-MS/MS條件

AFB1-TSB溶液：用V(苯)∶V(乙腈)=96∶4稀釋AFB1標(biāo)品,制備濃度為200 μg的溶液,加入20 mL TSB(調(diào)節(jié)pH中性)溶液中,水浴加熱,揮發(fā)有機(jī)溶劑,最終AFB1-TSB溶液質(zhì)量濃度為10 μg/mL。

UPLC-MS/MS條件：參考文獻(xiàn)[17,22]的方法。色譜,C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)；柱箱溫度40 ℃；流動(dòng)相(乙酸銨/甲醇)液相色譜梯度洗脫,條件見表2。

表2 液相色譜梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions for liquid chromatography

參考唐瓔等[17]等方法。質(zhì)譜條件：電離方式：電噴霧電離(ESI+)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；氣簾氣(CUR)：35 psi；碰撞氣(CAD)：medium；離子化電壓(IS)：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣(GSI)：55 psi；輔助加熱器(GS2)：60 psi。MRM參數(shù)見表3。

表3 AFB1的質(zhì)譜檢測(cè)條件Table 3 Mass spectrum parameter of AFB1

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,質(zhì)譜圖與NTST MS search 2.2軟件中標(biāo)準(zhǔn)譜庫比對(duì)[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株WTX1形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

實(shí)驗(yàn)室前期分離到1株AFB1降解率為83.5%的芽孢桿菌屬菌株WTX1,在TSA培養(yǎng)基上菌落呈乳黃色,表面粗糙不透明,褶皺隆起,菌株為革蘭氏陽性菌,菌體中央或兩側(cè)有芽孢。菌株WTX1形態(tài)特征見圖1,傳統(tǒng)微生物生理生化反應(yīng)及微生物全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)鑒定,菌株生理生化特征見表4。參考BA等[24]的方法,2株枯草芽孢桿菌分離鑒定結(jié)果及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、微生物全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)結(jié)果,如表5(95%置信為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis),初步鑒定菌株WTX1為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

a-菌落;b-革蘭氏染色;c-芽孢染色圖1 菌株WTX1形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological properties of WTX1

表4 菌株WTX1生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of stain WTX1

表5 菌株WTX1全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)結(jié)果Table 5 Results of automatic biochemical identification system for strain WTX1

2.2 WTX1菌株16S rRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

菌株16S rRNA保守基因,擴(kuò)增出一條1 500 bp左右的基因片段,見圖2。測(cè)序后序列運(yùn)用BLAST程序比對(duì),在GenBank中下載與WTX1菌株同源性較高的模式菌株序列。采用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖3。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果,菌株WTX1與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(登錄號(hào)：FJ867641.1)相似度達(dá)到99%,結(jié)合WTX1菌株形態(tài)學(xué)特征、生理生化特點(diǎn),鑒定WTX1菌株為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

圖2 WTX1菌株P(guān)CR 16SrRNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA sequences of strain WTX1

圖3 菌株WTX1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of stain WTX1

2.3 菌株WTX1生物量與降解率動(dòng)態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)研究接種發(fā)酵72 h內(nèi)菌株WTX1生物量變化與降解率之間的動(dòng)態(tài)聯(lián)系,結(jié)果如圖4所示。菌株以107CFU/mL濃度接種,發(fā)酵時(shí)間0～18 h,菌株生物量增長(zhǎng)緩慢,處于延滯期,降解率處于緩慢累積的過程,發(fā)酵18 h,降解率為5.34%；發(fā)酵時(shí)間18～42 h,菌株生物量大量增長(zhǎng),處于對(duì)數(shù)期,降解率增長(zhǎng)緩慢,發(fā)酵42 h,降解率為25.2%；發(fā)酵時(shí)間42～54 h,菌株生物量增長(zhǎng)緩慢,處于平衡期,降解率迅速增長(zhǎng),發(fā)酵54 h,降解率為74.4%；發(fā)酵時(shí)間54～72 h,菌株生物量緩慢下降,處于衰亡期,降解率緩慢增長(zhǎng),發(fā)酵72 h,降解率為86.5%；菌株降解率在平衡期迅速增加,可能菌株降解AFB1是生長(zhǎng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,研究進(jìn)一步分離菌株,發(fā)酵上清液,胞內(nèi)液,確定菌株降解AFB1起主要作用的組分。

圖4 菌株WTX1生物量與降解率動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of biomass and degradation rate of WTX1

2.4 菌株WTX1各組分降解機(jī)制研究

通過提取活菌體、發(fā)酵上清液、胞內(nèi)液,對(duì)質(zhì)量濃度為10 μg/mL的AFB1溶液進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證菌株WTX1吸附機(jī)制,結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵上清液的降解率最高,達(dá)到77.3%,活菌體和胞內(nèi)液降解能力較弱,分別是5.3%和9.3%。由此驗(yàn)證,菌株AFB1降解能力主要依賴菌株代謝分泌到發(fā)酵液中的酶或其他胞外物質(zhì),不是菌體本身或者胞內(nèi)代謝產(chǎn)物。

圖5 菌株AFB1降解功能組分Fig.5 Degradation rate of AFB1 in each component of strain

2.5 菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物分析

收集菌株降解液,通過UPLC-MS/MS方法采集降解上清液總離子流圖,如圖6所示,與AFB1-TSB標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖及質(zhì)譜圖作對(duì)比(圖7),扣除背景影響,總離子流圖中峰度較高的有6個(gè)峰。提取降解上清液總離子流圖中6個(gè)峰頂?shù)馁|(zhì)譜圖(圖8),導(dǎo)入NTST MS search 2.2軟件作比對(duì),根據(jù)保留時(shí)間與總離子流頂點(diǎn)的質(zhì)譜圖比較,保留時(shí)間在9.467 min的物質(zhì)是AFB1。其余產(chǎn)物1～5質(zhì)譜圖與AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖比較,綜合碎片離子大小,產(chǎn)物1～5與AFB1之間有若干碎片離子為同一物質(zhì)離子,如：39,51,63,77等。由此判斷,產(chǎn)物1～5與AFB1母體結(jié)構(gòu)有著較高的同源性,可能都為菌株WTX1降解AFB1的產(chǎn)物。由NTST MS search 2.2軟件比對(duì)結(jié)果可以得到,產(chǎn)物1～5可能的結(jié)構(gòu)如圖8所示,分別是產(chǎn)物1：C3H4,m/z:40.031 3；產(chǎn)物2：C6H6,m/z:78.046 9；產(chǎn)物3：C7H8O2,m/z:124.052 4；產(chǎn)物4：C8H6O2,m/z:134.036 77；產(chǎn)物5：C11H10O4,m/z:206.0579 09。WTX1將大分子AFB1降解為小分子物質(zhì),AFB1結(jié)構(gòu)中導(dǎo)致基因突變和致癌突變的呋喃環(huán)二氫雙鍵,以及致毒性的香蘭素內(nèi)脂環(huán)結(jié)構(gòu)都被菌株WTX1破壞。WTX1降解AFB1產(chǎn)物很多,本實(shí)驗(yàn)只研究了總離子流圖中峰值較高的5種產(chǎn)物,后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物是否具有致突變性。

圖6 菌株降解液總離子流圖Fig.6 Total ion chromatogram of strain degradation fluid

a-AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖;b-AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖圖7 AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖及質(zhì)譜圖Fig.7 Total ion chromatogram and mass spectrum of AFB1

a-產(chǎn)物1;b-產(chǎn)物2;c-產(chǎn)物3;d-產(chǎn)物4;e-產(chǎn)物5圖8 降解上清液提取質(zhì)譜圖及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖Fig.8 Mass spectrogram of degradation supernatant extraction and product structure

3 結(jié)論與討論

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的AFB1降解率高達(dá)83.5%的菌株WTX1為研究對(duì)象。通過16S rRNA及生化鑒定菌株WTX1是枯草芽孢桿菌。與ESHELLI等[25]篩選到一株降解率達(dá)96%的平紅球菌菌株相比較,枯草芽孢桿菌為人及哺乳動(dòng)物腸道益生菌,更具有食品安全優(yōu)勢(shì)。雖然菌株WTX1的降解率略低于前者,實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件,提高菌株降解率。

通過分析菌株各組分降解率,結(jié)合菌株生長(zhǎng)曲線,菌株降解AFB1主要是生長(zhǎng)過程產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物作用,可能是菌株代謝到胞外的酶或其他物質(zhì)。通過UPLC-MS/MS方法,采集降解液總離子流圖,創(chuàng)新結(jié)合NTST MS search 2.2軟件分析對(duì)比總離子流峰頂質(zhì)譜圖,得到WTX1菌株降解AFB1產(chǎn)生的5種產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。通過分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu),菌株WTX1降解AFB1機(jī)制是破壞AFB1起致基因突變和致癌突變的呋喃環(huán)二氫雙鍵結(jié)構(gòu),以及致毒性的香蘭素內(nèi)脂環(huán)結(jié)構(gòu),達(dá)到脫毒效果。

國(guó)內(nèi)生物降解AFB1研究多數(shù)為篩選可降解AFB1菌株及優(yōu)化發(fā)酵條件提高降解率,對(duì)降解產(chǎn)物研究較少。本研究首次利用質(zhì)譜檢測(cè)及NTST MS search 2.2軟件分析的方法,研究菌株WTX1降解產(chǎn)物,分析菌株降解產(chǎn)物,初步探究菌株降解機(jī)制。生物降解AFB1脫毒,多數(shù)將AFB1大分子降解為小分子物質(zhì),并破壞AFB1的毒性位點(diǎn)結(jié)構(gòu),實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究菌株WTX1降解產(chǎn)物對(duì)人及動(dòng)物代謝的影響,以備工業(yè)化應(yīng)用。