張小朋,陳貴才,嚴(yán)發(fā)杰,郭李坤,曾偉主,周景文*

1(甘肅匯能生物工程有限公司,甘肅 武威,733000) 2(浙江匯能生物股份有限公司,浙江 海寧,314422) 3(生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122)

那西肽(nosiheptide)又稱諾西肽,是一類含有多個(gè)噻唑環(huán)的硫多肽類抗生素,對革蘭氏陽性菌具有良好的抑制作用[1-2],具有不易被分解、用量低、抑菌范圍廣和不易殘留等特性,被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)中。在動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi),那西肽能夠持續(xù)地對腸道中的菌群生態(tài)進(jìn)行微調(diào)控,且具有促進(jìn)動(dòng)物生長的作用,被認(rèn)為是一種非常好的新型非吸收動(dòng)物添加劑[3-4]。目前,那西肽主要以發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn),其生產(chǎn)菌株主要為活躍鏈霉菌(Streptomyesactuosus)、抗生素鏈霉菌(Streptomyesantibiotics)和青灰色鏈霉菌(Streptomyesglaucogriseus),以活躍鏈霉菌的生產(chǎn)效果最佳[5-6]。

那西肽是一種次級代謝產(chǎn)物,具有復(fù)雜的合成途徑。已有研究針對其合成機(jī)制和作用功能進(jìn)行解析,另外,通過代謝工程等策略提高了那西肽效價(jià)[7-9]。目前工業(yè)上提高那西肽效價(jià)的方法主要為誘變育種和發(fā)酵過程優(yōu)化[10-12]。常用的誘變育種方法包括物理誘變和化學(xué)誘變等方法。刑新會(huì)等[13]開發(fā)了一種常壓室溫等離子體誘變育種技術(shù)(atmospheric and room temperature plasma,ARTP),該方法具有操作簡單、成本低、突變效率高等優(yōu)勢,已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、微藻、真菌、酵母等微生物。ARTP技術(shù)在阿維菌素、鹽霉素和頭孢菌素等抗生素高產(chǎn)菌株的篩選中取得了較好的效果[14-16]。然而,在篩選過程中大多數(shù)采用基于隨機(jī)篩選或抗性平板的篩選方法,存在工作量大、周期長、效率低及成本高等缺點(diǎn)[17-18]。近年來,具有自動(dòng)化、規(guī)?；臀⑿突膬?yōu)勢的高通量篩選方法(high-throughput screening,HTS)的興起,為那西肽等次級代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的高效篩選提供了平臺(tái)[19-20]。

依據(jù)那西肽的分子結(jié)構(gòu)特性,其與FeCl3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)生成的配合物,在520 nm可見光下能被快速檢測,基于此建立了一種高通量篩選方法。本研究利用ARTP誘變育種方法處理那西肽工業(yè)生產(chǎn)用菌株活躍鏈霉菌11-27,結(jié)合建立的高通量篩選方法篩選高產(chǎn)那西肽突變菌株,并考察其遺傳穩(wěn)定性和在50 m3工業(yè)發(fā)酵罐中的生產(chǎn)性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

活躍鏈霉菌Streptomycesactuosus11-27為甘肅匯能生物工程有限公司工業(yè)化生產(chǎn)那西肽用菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器

玉米淀粉、α-淀粉酶、黃豆餅粉、玉米漿、蛋白胨、豆油等,甘肅匯能生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ARTP誘變育種儀,無錫思清源生物科技有限公司；FE20K pH計(jì),瑞士Mettler-Toledo公司；FREEDOM EVO移液工作站,瑞士Tecan公司；QPix 420智能挑菌儀,美國Molecular公司；Cytation3酶標(biāo)儀,美國BioTek公司；Allegra X-15R離心機(jī),美國Bekman公司；Eppendorf 5424高速離心機(jī),美國Eppendorf公司；高效液相色譜儀,Shimadzu Corporation公司；50 m3發(fā)酵罐,浙江科美制藥機(jī)械有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉20,蛋白胨5,KNO31.0,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 0.5,CaCO35,瓊脂20；pH 7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉20,黃豆餅粉10,玉米漿20,(NH4)2SO42,CaCO35；pH 6.6～6.8,121 ℃滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉80,α-淀粉酶0.1,黃豆餅粉30,硫酸銨2,NaCl 2；KH2PO40.5,豆油5,CaCO35,121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備

用無菌生理鹽水從新鮮成熟的活躍鏈霉菌茄子瓶斜面上洗下一定量孢子,加入玻璃珠,振蕩30 min后經(jīng)脫脂棉、漏斗進(jìn)行過濾,梯度稀釋,將孢子懸液濃度調(diào)整至106～107個(gè)/mL,取1 mL孢子懸液于1.5 mL EP管中備用。

1.2.2 ARTP誘變

采用ARTP技術(shù)對出發(fā)菌株11-27進(jìn)行誘變處理。取10 μL制備好的孢子懸液均勻涂布于無菌載片表面。然后將載片置于ARTP誘變育種系統(tǒng)的載臺(tái)上,在入射功率為100 W、氦氣流量為10 SLM條件下,分別照射0、20、40、60、80、100、120、140和160 s。樣品處理完畢后,用鑷子將載片轉(zhuǎn)移至裝有1 mL無菌生理鹽水的EP管中振蕩重懸1 min,將附著在載片上的孢子充分洗脫形成孢子懸液。

1.2.3 致死率測定

將ARTP不同照射時(shí)間處理后的單孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋,取10-4、10-5梯度的0.2 mL孢子懸液涂布在固體分離平板培養(yǎng)基上(每個(gè)梯度進(jìn)行3組重復(fù)),于溫度為28 ℃、濕度50%～60%的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d,分別統(tǒng)計(jì)長出的菌落個(gè)數(shù),按照公式(1)計(jì)算致死率：

(1)

式中：U，對照組長出的平均菌落數(shù)；T，用ARTP技術(shù)處理后長出平均菌落數(shù)。

1.2.4 高通量篩選

應(yīng)用QPix 420智能挑菌儀將成熟后的單菌落挑選于含有800 μL液體培養(yǎng)基的96深孔板中,在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)28 h,以10%的接種量轉(zhuǎn)接于含有1 mL液體篩選培養(yǎng)基的48深孔板中,在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)4 d后,加入1 mL無水乙醇37 ℃保溫30 min,4 000 r/min離心15 min,取一定體積上清液,加入等體積無水乙醇,搖勻,取120 μL上述含有那西肽的樣品液于96淺孔板中,再加入80 μL 10 mmol/L的FeCl3溶液,靜置10 min后,用酶標(biāo)儀檢測520 nm處的吸光值,吸光值越高表明那西肽含量越高,挑取高于對照5%以上的優(yōu)勢菌株復(fù)篩。

將孔板初篩選取的優(yōu)勢菌株接種試管斜面,于28 ℃,濕度50%～60%培養(yǎng)7 d,成熟后轉(zhuǎn)接至搖瓶種子液中,28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)28 h,10%接種量接入搖瓶發(fā)酵液中,于28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)6 d,檢測效價(jià),挑取高于對照10%以上的優(yōu)勢菌株。

將搖瓶復(fù)篩選取的優(yōu)勢菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測,將確定了遺傳穩(wěn)定性的高產(chǎn)菌株砂土保藏。

1.2.5 高通量檢測

高通量檢測那西肽含量是通過全自動(dòng)移液工作站將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至96孔淺孔板中,加入FeCl3溶液,用酶標(biāo)儀檢測OD520處吸光值,吸光值越高表明那西肽含量越高。

1.2.6 液相檢測條件

采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵液中那西肽的含量。色譜柱：Diamonsil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；檢測器：示差檢測器；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V[水(0.025%磷酸)]=50∶50；流速：1 mL/min；柱溫：26 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線

ARTP誘變育種技術(shù)中所用的等離子體射流能打斷細(xì)胞內(nèi)C-N鍵、氨基鍵和P-O鍵,會(huì)導(dǎo)致大部分微生物死亡,但少部分會(huì)通過自身修復(fù)系統(tǒng)而存活下來,從而導(dǎo)致基因突變[21]?；钴S鏈霉菌經(jīng)ARTP誘變處理的致死率如圖1所示,菌株致死率隨誘變時(shí)間的增加而增加,當(dāng)處理時(shí)間為30 s時(shí),菌株已經(jīng)受到明顯損傷,致死率達(dá)60%；當(dāng)處理時(shí)間從30 s增加至40 s,致死率從60%急劇增加到90%；當(dāng)處理時(shí)間超過70 s后,菌株的致死率接近100%。

圖1 ARTP誘變致死曲線Fig.1 The lethality curve of ARTP treatment

研究報(bào)道ARTP誘變處理的致死率在90%以上的突變效果較好[22]。因此,本研究選取40～60 s間之的時(shí)間作為后續(xù)的誘變處理時(shí)間。

2.2 高通量篩選方法的建立

目前,那西肽常用的檢測方法包括高效液相色譜法、分光光度法。高效液相色譜法檢測精準(zhǔn)性高、范圍廣,但并不適用于高通量篩選檢測；分光光度法操作步驟繁瑣,處理時(shí)間長,檢測方法存在準(zhǔn)確度不高和重復(fù)性較差等問題[23]。那西肽為sp雜化化合物,具有的羥基與sp2雜化的C原子相連,易與FeCl3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng),生成的絡(luò)合物在某一特定波長下具有較大的響應(yīng)值。通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)在,該絡(luò)合物在520 nm可見光處的響應(yīng)值更高。為了選擇出最合適的FeCl3添加量(母液濃度為10 mmol/L),比較了200 μL總反應(yīng)體系中加入不同比例FeCl3溶液(VFeCl3母液∶V總體積,20∶200、40∶200、60∶200、80∶200、100∶200、120∶200)對檢測方法的影響,靜置10 min后用酶標(biāo)儀檢測OD520(檢測過程那西肽的終質(zhì)量濃度分別為0、125、250、375、500、625和750 μg/mL)。結(jié)果如圖2所示,當(dāng)FeCl3的加入體積比例為80∶200時(shí),檢測方法的線性化程度最佳,其線性方程為：Y=6.770 3×10-4X+0.369 8,R2=0.994 6。

FeCl3加入體積與總體積之比；a-20∶200；b-40∶200；c-60∶200；d-80∶200；e-100∶200；f-120∶200圖2 總體系中不同F(xiàn)eCl3溶液體積比的對比Fig.2 Comparison of different adding ratio of FeCl3 solution to the total system

2.3 高產(chǎn)菌株的高通量篩選

QPix 420微生物智能篩選系統(tǒng)和移液工作站具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、高通量和多參數(shù)同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn),已應(yīng)用于工業(yè)微生物的高通量篩選過程,從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)良菌株的高效篩選[20]。本研究應(yīng)用ARTP誘變處理那西肽工業(yè)生產(chǎn)菌株11-27,共進(jìn)行3輪次誘變處理,構(gòu)建了共有14 400株菌(96×150)的突變菌庫。應(yīng)用建立的高通量篩選方法從突變菌種庫中篩選出125株那西肽含量提高的突變菌株(圖3)。繼續(xù)對這125株突變菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩,以10%接種量轉(zhuǎn)接至25 mL篩選培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)6 d,高效液相色譜法檢測那西肽量。結(jié)果如圖4所示,其中有6株生產(chǎn)那西肽含量提升10%以上的突變株,分別為16-7D8、10-2F3、12-6G8、19-1F9、22-3B6、20-5D4,那西肽的效價(jià)較出發(fā)菌株11-27分別提高了10.3%、11.5%、12.0%、10.7%、13.7%、12.8%。

圖3 ARTP誘變初篩Fig.3 Primary screening with ARTP mutation

圖4 搖瓶復(fù)篩Fig.4 Second screening in the shake flasks

2.4 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性分析

為了驗(yàn)證突變菌株的遺產(chǎn)穩(wěn)定性,對ARTP誘變處理后獲得的6株高產(chǎn)菌株進(jìn)行連續(xù)傳代8次,以工業(yè)出發(fā)菌株11-27為對照。對其中第1代、第4代和第8代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,檢測突變菌株的發(fā)酵特性。結(jié)果如表1所示,傳代至第4代時(shí),突變體積累那西肽的含量基本沒大變化。傳至第8代時(shí),所有突變菌株積累的那西肽的含量與第1代和第4代的含量基本相當(dāng)。搖瓶驗(yàn)證結(jié)果表明6株高通量篩選獲得的突變菌株具有穩(wěn)定的遺傳特性。

表1 突變菌株遺傳穩(wěn)定性Table 1 The genetic stability of mutant strains

2.5 高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)發(fā)酵驗(yàn)證

將那西肽效價(jià)提高最顯著的誘變株22-3B6繼續(xù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證。菌株活化后在50 m3罐發(fā)酵生產(chǎn)16批次,發(fā)酵200 h后,發(fā)酵液經(jīng)預(yù)處理提取干燥后檢測效價(jià),生產(chǎn)過程以原始菌株11-27為對照。結(jié)果如圖5所示,誘變菌株22-3B6生產(chǎn)16個(gè)批次的那西肽的平均效價(jià)為5 272 μg/mL,相比對照株11-27(4 788 μg/mL),其效價(jià)提高了10.1%,生產(chǎn)過程的轉(zhuǎn)化效果提升明顯。

圖5 突變菌株22-3B6的生產(chǎn)驗(yàn)證Fig.5 Industrial verification of mutant 22-3B6

3 結(jié)論

那西肽是一類典型的可抑制革蘭氏陽性菌的含硫類抗生素,由于其安全、低毒性、無殘留和促生長等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑中[24-25]。目前,那西肽的生產(chǎn)主要以活躍鏈霉菌發(fā)酵法生產(chǎn)。近年來,研究人員通過誘變育種、基因組重排、那西肽合成前導(dǎo)肽的改造和發(fā)酵過程優(yōu)化與控制等策略提高了那西肽的效價(jià)[26-27]。但由于篩選通量低和人工負(fù)擔(dān)重的限制,那西肽優(yōu)良工業(yè)生產(chǎn)菌株的獲得仍面臨許多挑戰(zhàn)。

本研究基于那西肽分子雜化的特征,其與FeCl3形成的絡(luò)合物在可見光520 nm處具有較明顯的響應(yīng)值,構(gòu)建了一種用于篩選那西肽高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法。結(jié)合ARTP誘變育種技術(shù),從14 400株突變菌株中篩選出6株那西肽效價(jià)明顯提高的突變菌,檢測該6株菌在合成那西肽方面具有較高的遺傳穩(wěn)定性。最終,將優(yōu)良菌株22-3B6在50 m3發(fā)酵罐中進(jìn)行生產(chǎn)性能的驗(yàn)證,結(jié)果表明,與原始菌株相比,22-3B6積累那西肽的效價(jià)提高了10.1%。本研究應(yīng)用ARTP誘變技術(shù)和高通量篩選技術(shù),高效、快速地獲得了高產(chǎn)那西肽的突變菌株,表明應(yīng)用突變菌株能有效降低那西肽的生產(chǎn)成本,增強(qiáng)企業(yè)的核心競爭力。近年來,通過基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等生物信息學(xué)技術(shù)解析了鏈霉菌合成那西肽的合成基因簇,并應(yīng)用代謝工程手段強(qiáng)化了菌株中那西肽的合成[28-29]。另外,合成生物學(xué)技術(shù)的興起為強(qiáng)化抗生素等次級代謝產(chǎn)物的生物合成帶來了機(jī)遇。因此,在后續(xù)研究中,可繼續(xù)采取流式細(xì)胞分選、重離子誘變、基于代謝工程和合成生物技術(shù)的理性改造以及基于微型反應(yīng)器優(yōu)化發(fā)酵過程等策略進(jìn)一步提高活躍鏈霉菌生產(chǎn)那西肽的能力。