吳沙沙 牟大超 繆治永 焦 令 周 軼

當(dāng)前，由于環(huán)境污染、生活方式改變、病原體感染等因素，腫瘤已成為成為人類死亡的最大致病因素，嚴(yán)重影響著人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1-3]。隨著基礎(chǔ)免疫學(xué)的發(fā)展和對腫瘤認(rèn)識(shí)的深入，腫瘤免疫治療已成為繼手術(shù)治療、放療和化療后的有效治療手段[4-5]。早在20世紀(jì)初，Leyden和Blumenthal就應(yīng)用腫瘤疫苗進(jìn)行了特異性免疫治療[6]。隨著20世紀(jì)40年代腫瘤特異性抗原(TSA)的發(fā)現(xiàn)和眾多免疫檢查點(diǎn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)，奠定了腫瘤免疫學(xué)基礎(chǔ)[7-8]。

腫瘤的免疫療法發(fā)展至今已有眾多技術(shù)手段，大體可分為過繼免疫細(xì)胞療法和抗體靶向治療，以及腫瘤疫苗等[9-12]。其中過繼免疫細(xì)胞治療包括CAR-T、CAR-NK、DC治療等[13]?？贵w靶向治療包括PD-1、PD-L1、CTLA4等[14-15]。腫瘤疫苗包括腫瘤全細(xì)胞疫苗、DC疫苗、CTL表位疫苗，以及靶向腫瘤新生血管疫苗等。2014年日本和美國FDA先后批準(zhǔn)PD-1抗體用于治療晚期黑色素瘤。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，結(jié)合淋巴細(xì)胞膜上PD-1后能抑制B細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖，發(fā)生腫瘤免疫逃逸[16]。因此，給予PD-1或PD-L1抗體治療，在體內(nèi)競爭性結(jié)合，通過阻斷T細(xì)胞的抑制信號，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[17]。RAW264.7屬小鼠巨噬細(xì)胞系，是白血病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞，可表達(dá)PD-1。本課題旨在研究我科室制備的RAW264.7細(xì)胞蛋白和PD-L1抗體對于小鼠黑色素瘤(B16)的抑瘤效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 B16黑色素瘤細(xì)胞由四川大學(xué)華西醫(yī)院生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊寒朔教授惠贈(zèng)，本室保種傳代。小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7由四川大學(xué)華西醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心提供，本室傳代保種。產(chǎn)PD-L1抗體的雜交瘤細(xì)胞株10B5由陳列平教授課題組惠贈(zèng)。C57BL/6雌性小鼠，清潔級，6～8周,購自四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-03]。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM高糖培養(yǎng)基和青霉素鏈霉素購自Gibco公司，胎牛血清購自阿根廷Natocor公司，TMB單組分顯色液購自北京索萊寶科技有限公司，CD3、CD4和CD8流式抗體均購自BD公司。PD-L1抗體購自NOVUS(NBP1-76769)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 B16細(xì)胞和雜交瘤10B5細(xì)胞培養(yǎng) B16于含有10% FBS，青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。雜交瘤10B5細(xì)胞于含有10% FBS，青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 PD-L1抗體制備和驗(yàn)證 收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清1L，于800 g離心10 min去除細(xì)胞碎片沉淀，0.22 μm濾膜過濾，用protein G蛋白純化柱在蛋白純化儀上純化PD-L1抗體。純化后的蛋白抗體用BCA法測定蛋白濃度，同時(shí)取少量蛋白抗體加蛋白loading buffer變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，同時(shí)用western blot方法驗(yàn)證抗體特異性。

1.2.3 Raw264.7細(xì)胞蛋白制備 收集傳代培養(yǎng)的Raw264.7細(xì)胞，用5 ml RIPA于冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃，15 000 g離心5 min收集蛋白上清，用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.4 C57小鼠腫瘤模型建立 取對數(shù)生長的B16細(xì)胞，用生理鹽水稀釋成濃度為4×106/ml細(xì)胞懸液，每只小鼠背部皮下接種細(xì)胞2×105個(gè)細(xì)胞，用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤的長徑和寬徑，待腫瘤平均體積達(dá)到100 mm3時(shí)，開始給藥治療。

1.2.5 RAW264.7細(xì)胞蛋白和PD-L1抗體治療腫瘤小鼠 腫瘤小鼠隨機(jī)分成3組，每組10只小鼠，組A為RAW264.7蛋白治療組，劑量為50 μg蛋白/只,一周后以相同劑量再次給藥一次；組B為PD-L1抗體治療組，劑量為600 μg/只，每隔3天給藥1次，共給藥4次；組3為生理鹽水對照組。3組治療方法均為腹腔注射。

1.2.6 荷瘤小鼠脾臟CD3，CD4和CD8流式分析 經(jīng)過治療的小鼠，在最后1次測量腫瘤體積后脫頸處死，無菌取脾臟研磨，過70 μm篩網(wǎng)，裂解紅細(xì)胞，分別在100 μl的FACS buffer中加CD3，CD4，CD8流式抗體染色30 min，離心重懸后立即流式分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。小鼠腫瘤體積分析均采用單因素重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析；流式數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。P<0.05判定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1抗體和RAW264.7蛋白制備

1l細(xì)胞培養(yǎng)上清共純化出8 ml PD-L1抗體,濃度為6.38 mg/ml?？捡R斯亮藍(lán)染色顯示，經(jīng)過變性后的抗體，包括部分未解鏈的全抗體和部分解離成輕鏈和重鏈的抗體片段(圖1)。Western blot顯示純化的PD-L1抗體確實(shí)能夠與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合產(chǎn)生條帶(圖2)。收集對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，RIPA裂解后提取總蛋白，經(jīng)WB驗(yàn)證可與PD-L1特異性結(jié)合。

圖1 純化PD-L1抗體考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

圖2 RAW264.7細(xì)胞蛋白于PD-L1特異性結(jié)合western blot結(jié)果

2.2 RAW264.7細(xì)胞蛋白和PD-L1抗體治療腫瘤小鼠結(jié)果

三組荷瘤小鼠接受治療后，每3天測量腫瘤體積大小。結(jié)果顯示，生理鹽水對照組(group C)小鼠腫瘤生長最快，PD-L1抗體治療組(group B)次之，RAW264.7蛋白治療組(group A)腫瘤生長速度最慢，具有顯著性差異(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組荷瘤小鼠治療后腫瘤生長情況

2.3 荷瘤小鼠免疫細(xì)胞群流式細(xì)胞術(shù)分析

接種腫瘤后經(jīng)過蛋白治療12天后，無菌取脾，制成單細(xì)胞懸液，流式抗體CD3、CD4、CD8染色分析細(xì)胞群落。結(jié)果顯示，3組荷瘤小鼠，用PD-L1抗體治療后，淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞比例比其他兩組的均較低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，RAW264.7蛋白治療組(group A)CD4+和CD8+比例與生理鹽水治療組(group C)相比未見明顯差異，見圖4。

圖4 各組小鼠脾臟免疫細(xì)胞群流式細(xì)胞術(shù)分析

3 討論

自20世紀(jì)50年代免疫監(jiān)視學(xué)說被提出以來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括PD-1、PD-L1、CTLA-4等已成為抗腫瘤領(lǐng)域的治療熱點(diǎn)。程序性死亡受體1(programmed cell death protein,PD-1)是T細(xì)胞表面的一類抑制性受體，當(dāng)與腫瘤表面的配體PD-L1(programmed cell death-1 Ligands)結(jié)合時(shí)，能誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭，抑制T細(xì)胞功能，從而發(fā)生腫瘤免疫逃逸。因此，針對PD-1或PD-L1的單克隆抗體可阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合，從而抑制負(fù)調(diào)控信號，使T細(xì)胞恢復(fù)活力[18-19]。本課題組利用雜交瘤細(xì)胞系10B5制備大量PD-L1單克隆抗體，并進(jìn)行純化、驗(yàn)證。western blot驗(yàn)證結(jié)果顯示，所制備的PD-L1單克隆抗體變性后樣本出現(xiàn)三條帶，包括分子量為130 KD的抗體全長、分子量為55KD的抗體重鏈以及分子量為25KD的抗體輕鏈序列。此外，本課題組通過培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，提取總蛋白，WB結(jié)果顯示，該蛋白能與PD-L1特異性結(jié)合。

在小鼠接種B16腫瘤細(xì)胞后，待腫瘤體積平均達(dá)到100 mm3后，3組小鼠分別進(jìn)行RAW264.7蛋白(組A)、PD-L1抗體(組B)和生理鹽水對照(組C)治療。在治療后，組C小鼠體積增長迅速，在末次測量時(shí)平均體積達(dá)到4004 mm3，腫瘤生長趨勢已報(bào)道的研究結(jié)果類似[20]；組B和組C小鼠體積增長緩慢，在給藥后12天小鼠腫瘤平均體積分別為1637 mm3和882 mm3。3組小鼠在治療結(jié)束后，分別取脾臟，制備單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)分析CD3、CD4、CD8細(xì)胞群顯示：給予PD-L1抗體治療后小鼠CD3+CD8+T cell數(shù)目顯著增加，達(dá)到77.65%(P<0.01)，CD3+CD4+T cell群數(shù)目減少，提示機(jī)體CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有殺傷性的CD8+T細(xì)胞；而組A和組C兩組CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)未見顯著性差異，但兩者CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)均略高于C57空白小鼠。

腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑療法已成為眾多醫(yī)藥企業(yè)和科研院所的關(guān)注重點(diǎn)，我課題組制備的PD-L1抗體和RAW264.7蛋白能分別于體內(nèi)PD-1和PD-L1競爭性結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的負(fù)調(diào)控信號，使之能有效識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。隨著腫瘤特異性抗原逐漸被發(fā)現(xiàn)，更多免疫檢查點(diǎn)必將被揭示，單克隆抗體抑制劑也將在腫瘤免疫治療領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。