杜靜怡 徐興祥， 卞家蓉

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。由于早期缺乏癥狀，確診時(shí)大部分患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，全球肺癌的5年生存率僅為5%～15%[2]。非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最常見的組織類型，占80%～85%。肺腺癌是NSCLC 中最常見的亞型，肺鱗癌（Lung squamous cell carcinoma，LUSC）是第二常見亞型[3]。大多數(shù)NSCLC 發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，預(yù)后較差。大量研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cells，CTCs）計(jì)數(shù)在腫瘤療效預(yù)測(cè)、預(yù)后評(píng)估以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)方面具有重要作用。Krebs 等[4]研究表明CTCs計(jì)數(shù)與NSCLC 化療療效密切相關(guān)，但是目前尚未形成CTCs計(jì)數(shù)與聯(lián)合治療療效方面的評(píng)估體系?；诖?，本研究旨在分析CTCs 在晚期LUSC患者治療中的療效評(píng)價(jià)及預(yù)后評(píng)估價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2018年10月～2020年2月于揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院診治并接受CTCs檢測(cè)的晚期LUSC患者39例。根據(jù)國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)（IASLC） 制定的第八版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。本研究經(jīng)揚(yáng)州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75周歲；②患者的東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）評(píng)分0～1分；③經(jīng)組織病理學(xué)確診為L(zhǎng)USC，且TNM分期為Ⅲ期或Ⅳ期；④既往未接受過(guò)系統(tǒng)性抗腫瘤化療；⑤自愿參與本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病者；②存在腦轉(zhuǎn)移者；③嚴(yán)重心、肺、腎等臟器疾病者；④無(wú)法配合采集標(biāo)本和資料者。

1.3 治療方法39例晚期LUSC患者中，實(shí)驗(yàn)組15例采用卡瑞利珠單抗聯(lián)合卡鉑+紫杉醇治療方案：第1天靜脈滴注200mg 卡瑞利珠單抗、卡鉑AUC=5、紫杉醇175mg/m2，21d 為1個(gè)療程，共2個(gè)療程。對(duì)照組24例采用安慰劑聯(lián)合卡鉑+紫杉醇治療方案：第1天靜脈滴注200mg 安慰劑、卡鉑AUC=5、紫杉醇175mg/m2，21d 為1個(gè)療程，共2個(gè)療程。

1.4 臨床與實(shí)驗(yàn)室評(píng)估患者治療前均接受標(biāo)準(zhǔn)的臨床和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估，包括胸腹部增強(qiáng)計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、頭部增強(qiáng)磁共振成像、骨掃描（ECT），并于每2個(gè)治療周期后通過(guò)影像學(xué)檢查進(jìn)行腫瘤評(píng)估，或在懷疑疾病發(fā)生進(jìn)展時(shí)對(duì)腫瘤進(jìn)行影像學(xué)評(píng)估。無(wú)進(jìn)展生存期（Progression-free survival，PFS）定義為從開始治療到患者疾病進(jìn)展或其他原因死亡所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。

1.5 外周血CTCs檢測(cè)方法及截?cái)嘀蹬卸ǚ謩e于治療前及第2療程治療結(jié)束后當(dāng)天采集患者上肢靜脈血6ml，放置于含有ACD 抗凝劑的真空采血管（Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA）中。采用SE-i·FISH?CTC 試劑盒（Cytointelligen，San Diego，CA，USA）富集NSCLC患者外周血中的腫瘤細(xì)胞[5，6]，iFISH試劑盒（Cytointelligen，San Diego，CA，USA）對(duì)富集的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)。操作均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。目前國(guó)際上對(duì)CTCs截?cái)嘀禌](méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，在本研究中以CTCs=5個(gè)/6ml外周血作為NSCLC CTCs 的截?cái)嘀礫7]。

1.6 療效評(píng)價(jià)肺癌治療療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)體腫瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（Response evaluation criteria in solid tumor，RECIST） 1.1[8]。完全緩解（Complete response，CR）：所有靶病灶消失；部分緩解（Partial response，PR）：靶病灶直徑之和比基線水平減少至少30%；疾病進(jìn)展（Progressive disease，PD）：靶病灶直徑之和增加至少20%，或出現(xiàn)1個(gè)或多個(gè)新病灶；疾病穩(wěn)定（Stable disease，SD）：靶病灶減小的程度沒(méi)有達(dá)到PR，增加的程度也沒(méi)有達(dá)到PD 水平。疾病控制（Disease control，DC）為CR+PR+SD。RECIST 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)治療有效為DC，治療無(wú)效包括PD。

CTCs 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：治療有效指治療后外周血CTCs數(shù)量下降≥1/5，治療無(wú)效指治療后外周血CTCs數(shù)量不變或升高＞1/5[4]。

1.7 隨訪隨訪截至2020年12月1日，入組的39例患者全部完成隨訪，隨訪率100%。以疾病出現(xiàn)進(jìn)展或者患者死亡為隨訪終點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料應(yīng)用Shapiro-Wilk 先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，得到計(jì)量資料均不符合正態(tài)分布，故采用中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，分類資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)（%）表示。計(jì)量資料組間比較，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)系數(shù)對(duì)CTCs數(shù)量變化與治療療效進(jìn)行相關(guān)性分析。Fisher 精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)RECIST和CTCs 兩種療效判定方法。生存分析采用Kalplan-Meier 生存曲線。兩組間差異比較采用Log-rank 檢驗(yàn)。單因素及多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 晚期LUSC患者基線CTCs數(shù)目與臨床病理特征的關(guān)系本研究共納入39例晚期LUSC患者，患者均檢測(cè)到CTCs，CTCs檢出率100%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，基線CTCs數(shù)目與不同的年齡區(qū)間、性別、吸煙史、TNM分期、治療前有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及ECOG 評(píng)分患者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與腫瘤最大直徑的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 晚期LUSC患者基線CTCs數(shù)目與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 治療方法和CTCs數(shù)量變化與治療效果的關(guān)系RECIST 1.1 評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，治療2個(gè)療程后，采用卡瑞利珠單抗聯(lián)合卡鉑+紫杉醇治療的患者，PD 4例，DC 11例。DC患者中，CTCs數(shù)目升高的有2例，CTCs數(shù)目不變/下降的有9例；采用安慰劑聯(lián)合卡鉑+紫杉醇治療的患者，PD 9例，DC 15例。DC患者中，CTCs數(shù)目升高的有9例，CTCs數(shù)目不變/下降的有6例。對(duì)CTCs數(shù)目變化和治療效果行Spearman 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CTCs數(shù)目變化與卡瑞利珠單抗聯(lián)合卡鉑+紫杉醇療效之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.533，P=0.041），而與安慰劑聯(lián)合卡鉑+紫杉醇療效之間無(wú)相關(guān)性（r=0.258，P=0.223），見表2。

2.3 CTCs與RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)比較治療2個(gè)療程后，按照CTCs 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定，有效者22例，無(wú)效者17例。按照RECIST 標(biāo)準(zhǔn)判定，有效者26例，無(wú)效者13例。采用Fisher 精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種療效判定方法，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.00＞0.05），即CTCs評(píng)價(jià)可作為治療效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，見表3。

表2 CTCs數(shù)目變化與兩種治療方案的關(guān)系[n（%）]

表3 CTCs 與RECIST 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)比較[n（%）]

2.4 CTCs數(shù)量與晚期LUSC患者PFS生存曲線39例晚期LUSC患者中基線CTCs＜5個(gè)/6ml 外周血和≥5個(gè)/6ml 外周血分別為14例和25例，中位PFS分別為34.92周（95%CI：28.45～41.39）和22.37周（95%CI：17.85～26.88），Log-rank 檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.730，P=0.005），見圖1。治療2個(gè)療程后，CTCs＜5個(gè)/6ml 外周血的患者和≥5個(gè)/6ml外周血的患者分別為22例和17例，中位PFS分別為33.42周（95%CI：24.39～42.45） 和22.80 周（95%CI：13.23～32.37），Log-rank 檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.775，P=0.009），見圖2。

圖1 晚期LUSC患者的生存曲線

圖2 治療后晚期LUSC患者的生存曲線

2.5 不同治療方式與晚期LUSC患者PFS生存曲線39例晚期LUSC患者，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中位PFS分別為33.65周（95%CI：28.13～39.18）和21.11周（95%CI：16.86～25.37），Log-rank 檢驗(yàn)顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.954，P=0.001），見圖3。

圖3 不同治療方式下晚期LUSC患者的生存曲線

2.6 單因素與多因素分析采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析對(duì)39例晚期LUSC患者的臨床病理特征及基線CTCs數(shù)目進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，腫瘤最大直徑、治療方式、NSE、基線CTCs數(shù)目與PFS 有相關(guān)性（P<0.05）。將單因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析中有意義的4個(gè)指標(biāo)作為自變量，進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，不同的治療方式、基線CTCs數(shù)目是影響患者PFS 的獨(dú)立影響因素（P<0.05），見表4、5。

表4 影響晚期LUSC患者PFS 單因素分析

表5 影響晚期LUSC患者PFS 多因素分析

續(xù)表4

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的首要原因，盡管癌癥治療取得了一定進(jìn)展，但晚期肺癌的總體五年生存率仍然不到20%[1]。化學(xué)療法、放射療法和外科技術(shù)的進(jìn)步使得晚期NSCLC 的PFS 和總生存期（Overall survival，OS）顯著提高，但OS 仍然很低。含鉑雙藥化療是身體狀況較好（PS 0～1）的晚期NSCLC 標(biāo)準(zhǔn)化療方案，然而，在PS≥2 的患者和老年患者中，這種聯(lián)合治療發(fā)生不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)很高[9]。針對(duì)程序性死亡蛋白1（Programmed death-1，PD-1）/程序性死亡配體1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）已被發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上可以提高肺癌患者的生存率，并且已經(jīng)成為晚期NSCLC 主要的免疫療法，改變了晚期腫瘤的治療模式。但是并非所有的NSCLC患者均能從中受益。近年來(lái)，為使更多的患者受益于免疫治療，越來(lái)越多的聯(lián)合治療均在探索中，其中聯(lián)合化療是目前的研究熱點(diǎn)。已有研究表明，抗PD-1/PD-L1 的ICIs 聯(lián)合鉑類化療可以改善晚期NSCLC患者的預(yù)后，并延長(zhǎng)其生存期[10]。在本研究中，接受PD-1 抑制劑卡瑞利珠單抗聯(lián)合卡鉑+紫杉醇治療的晚期LUSC患者的PFS 明顯高于安慰劑聯(lián)合卡鉑+紫杉醇的患者。但是免疫治療并非在所有情況下均有效，臨床醫(yī)生仍需要使用可靠的生物標(biāo)志物來(lái)選擇可能受益的患者及評(píng)估療效、預(yù)后。當(dāng)前對(duì)中晚期肺癌療效的評(píng)價(jià)普遍采用RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，然而主要依賴CT檢測(cè)的RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)療效的判定存在一定的滯后性。CTCs檢測(cè)作為一種新興的液體活檢技術(shù)，有望為癌癥檢測(cè)和疾病監(jiān)測(cè)提供一種非侵入性手段。

CTCs是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤部位分離出來(lái)的，可以逃脫人體免疫系統(tǒng)，并在循環(huán)系統(tǒng)中存活的腫瘤細(xì)胞[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs 存在于惡性腫瘤患者體內(nèi)，如肺癌、前列腺癌、乳腺癌等，幾乎不存在于健康人群中[12]。若在腫瘤患者外周血中檢測(cè)到CTCs，則提示預(yù)后不良[13]。本研究中，所有患者均檢測(cè)出CTCs。在各種實(shí)體腫瘤類型中，CTCs 已被確定為腫瘤進(jìn)展的危險(xiǎn)因素。近年來(lái)，CTCs計(jì)數(shù)也已被證明是NSCLC 的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。Krebs 等[4]通過(guò)CellSearch 系統(tǒng)評(píng)估了101例接受標(biāo)準(zhǔn)化療的晚期NSCLC患者CTCs計(jì)數(shù)的預(yù)后價(jià)值。在多因素分析中，基線時(shí)較高的CTCs計(jì)數(shù)與較 差 的PFS（HR：4.85；95%CI：1.93～12.17；P=0.001）和OS （HR：7.92；95%CI：2.85～22.01；P<0.001）相關(guān)。本研究證實(shí)了晚期LUSC患者基線CTCs計(jì)數(shù)與PFS 相關(guān)，基線CTCs數(shù)目≥5個(gè)/6ml 外周血的患者PFS 明顯低于基線CTCs數(shù)目＜5個(gè)/6ml 外周血的患者，且在多因素分析中基線CTCs計(jì)數(shù)是影響患者PFS 的獨(dú)立因素，這與既往研究結(jié)果一致[14]。本研究還表明，39例晚期LUSC患者在治療2個(gè)療程后，CTCs數(shù)目≥5個(gè)/6ml 外周血的患者PFS 顯著低于CTCs數(shù)目＜5個(gè)/6ml 外周血的患者，這些結(jié)果提示CTCs 可能預(yù)測(cè)晚期LUSC患者的遠(yuǎn)期生存。與組織活檢相比，CTCs 可以更好地反映腫瘤的異質(zhì)性，已逐漸成為監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及評(píng)估療效、預(yù)后的重要手段。有研究表明，化療后CTCs計(jì)數(shù)與腫瘤大小密切相關(guān)[15]。Hirose 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，CTCs計(jì)數(shù)可能是轉(zhuǎn)移性NSCLC患者化療療效的預(yù)測(cè)因素。然而Zhou 等[17]的研究卻表明CTCs計(jì)數(shù)變化與化療療效無(wú)相關(guān)性。Juan 等[18]評(píng)估了37例晚期NSCLC患者在基線和化療2個(gè)月后的CTCs 水平，發(fā)現(xiàn)化療2個(gè)月后PFS 無(wú)顯著差異（P=0.45）。在本研究中，PD-1 抑制劑卡瑞利珠單抗聯(lián)合卡鉑+紫杉醇治療的晚期LUSC患者，治療前后CTCs數(shù)目變化與療效呈顯著負(fù)相關(guān)，即CTCs數(shù)目不變/減少或動(dòng)態(tài)增多與RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為DC 或PD 相關(guān)，而安慰劑聯(lián)合卡鉑+紫杉醇的患者，治療前后CTCs數(shù)目變化則與療效無(wú)關(guān)。在未來(lái)，需要更多的研究來(lái)確定CTCs計(jì)數(shù)與治療效果間是否確實(shí)存在相關(guān)性。

本研究結(jié)果顯示，晚期LUSC患者基線CTCs數(shù)目與腫瘤最大直徑密切相關(guān)，而與年齡、性別、吸煙史、TNM分期、治療前有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及ECOG 評(píng)分無(wú)關(guān)。目前關(guān)于CTCs 與TNM分期之間的相關(guān)性存在爭(zhēng)議，Wei 等[19]的研究顯示，Ⅳ期NSCLC患者中CTCs數(shù)目明顯高于Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ期患者。而Zhou 等[17]的研究表明，CTCs計(jì)數(shù)與TNM分期無(wú)相關(guān)性，但與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。這可能與所采用的CTCs檢測(cè)技術(shù)不同，納入的研究患者不同以及個(gè)體異質(zhì)性有關(guān)。然而，本研究納入樣本量較少、觀察周期較短，仍需更多臨床研究來(lái)證實(shí)上述觀點(diǎn)。

綜上所述，免疫聯(lián)合化療是有望成為進(jìn)一步提高免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞能力的新策略。外周血CTCs檢測(cè)有助于評(píng)估患者療效及預(yù)后，且有望成為評(píng)價(jià)晚期LUSC 治療效果的標(biāo)準(zhǔn)。