劉學(xué)賢，杜 斌，郭 湘，薛驥軒，于雷濤，范瑞文

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

microRNA (miRNAs)是一種非編碼小RNA分子，對動植物的發(fā)育生理等相關(guān)基因的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用[1-2]。miRNAs在哺乳動物如小鼠、山羊和綿羊以及羊駝皮膚中具有多種調(diào)控作用，可以通過調(diào)節(jié)色素顆粒的合成參與毛發(fā)顏色的調(diào)控[3-6]。先前的研究表明，miR-146a靶向酪氨酸相關(guān)蛋白1(tyrosinase related protein 1，TYRP1)抑制小鼠黑素細(xì)胞黑色素的生成[7]。有研究表明，miR-146a對小鼠自身免疫、骨髓增生和癌癥具有顯著的抑制作用[8]。此外，miR-146a對胰腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移有不同的影響[9]。

羊駝是重要的毛用型經(jīng)濟(jì)動物，毛纖維具有22種 天然色，是研究毛色形成分子機制的理想模型。在黑色素細(xì)胞中，miRNAs的功能是多樣性的，雖然已發(fā)現(xiàn)miR-146a可以抑制小鼠黑色素的生成，但是否對其他生物學(xué)功能起調(diào)控作用還未見報道。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測絲裂原活化蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4，MAPK4)和肌漿球蛋白Va (MyosinVa)也是miR-146a的靶基因，其中，MAPK4是絲裂原激活蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的典型成員(也稱ERK4，p63MAPK)，參與了很多疾病包括腫瘤轉(zhuǎn)移等的發(fā)生過程[10-11]。MAPK信號通路涉及很多生物進(jìn)程，也是影響細(xì)胞增殖的通路之一，同時也參與細(xì)胞的增殖、分化等生理過程[12]。當(dāng)MAPK被激活后可相應(yīng)地激活一些下游因子，如cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive-element binding protein，CREB)和絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase kinase 1，MEK1)，活化的CREB可調(diào)控小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子MITF(microphthalmia-associated transcription factor)的轉(zhuǎn)錄[13]，當(dāng)MAPK信號通路被激活后，MEK1可被磷酸化，磷酸化的MEK1可調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化[14-15]。Myosin Va屬于V類肌凝蛋白，在細(xì)胞內(nèi)囊泡沿肌動蛋白絲運輸?shù)侥狱c的過程中起重要作用[16]。在黑色素細(xì)胞的黑素體運輸和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的顆粒分泌中，MyosinVa已被證明是至關(guān)重要的[17-18]，是黑素小體轉(zhuǎn)運機制的重要組成部分[19]，且被認(rèn)為是與突出結(jié)合蛋白黑色素親和素(melanophilin，MLPH)和 ras 相關(guān)蛋白結(jié)合 27a (Ras-related protein binding 27a，Rab27a)形成復(fù)合體的關(guān)鍵蛋白，在捕獲和短距離傳遞黑素體到黑色素細(xì)胞外周的過程中起重要作用[20-23]。因此，為了探求miR-146a在羊駝黑色素細(xì)胞中通過與其靶基因MAPK4和MyosinVa靶向結(jié)合后可能調(diào)控其下游基因并影響羊駝黑色素細(xì)胞的增殖和遷移的功能。本試驗通過在羊駝黑色素細(xì)胞中脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-146a，從而揭示miR-146a對羊駝黑色素細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

羊駝黑色素細(xì)胞和293T細(xì)胞由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室提供。miR-146a mimic、inhibitor和NC (大小為20 bp的置位序列，與其他miRNA 沒有同源性)由廣州銳博生物科技有限公司合成。NheI、XbaI、XhoI(TaKaRa公司)，pmirGL0-luciferase miRNA Target Expression Vector(Promega，美國)，Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega，美國)，膠回收試劑盒(康為世紀(jì))，兔抗MAPK4、Myosin Va、MEK1、p-MEK1、CREB、MITF、MLPH、Rab27a多克隆抗體(北京博奧森)，抗兔、抗鼠二抗(武漢博士德), Trizol(Invitorgen，美國)，氨芐霉素、轉(zhuǎn)染試劑(Invitorgen，美國)，SYBR Prime Script TMRT PCR KIT(TaKaRa公司)，蛋白marker(Thermo，美國)，Cell Counting Kit-8(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 pmirGL0-MAPK4-3′ UTR和pmirGL0-Myosin Va-3′ UTR雙熒光報告載體的構(gòu)建 從羊駝黑色素細(xì)胞中提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增純化產(chǎn)物和 pmirGL0 載體分別用NheI、XbaI和NheI、XhoI于 37 ℃雙酶切3 h，產(chǎn)物4 ℃連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑取菌斑，搖菌后提取質(zhì)粒測序。

1.2.2 293T和羊駝黑色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 將293T細(xì)胞和羊駝黑色素細(xì)胞從液氮中取出置于37 ℃ 水浴復(fù)蘇，完全融化后放在低速離心機4 ℃離心10 min,接種于6孔板(每孔1×106個細(xì)胞),在37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到75%左右時，用miR-146a mimic、inhibitor和NC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 雙熒光素酶活性試驗檢測miR-146a與MAPK4、MyosinVa的靶向關(guān)系 終止轉(zhuǎn)染72 h 的羊駝黑色素細(xì)胞用PBS洗滌3次，按照先前檢測雙熒光素酶的步驟[6]檢測熒光素酶活性：每孔加100 μL的PLB置于混勻儀上15 min，在96孔加樣孔中每孔加入50 μL上述所得溶液，加入100 μL LAR-Ⅱ試劑讀取螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度值，然后再加入100 μL Stop&Glo試劑，最后讀取海腎螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強度值。結(jié)果用螢火蟲螢光素酶值/海腎螢光素酶值來表示。

1.2.4 qPCR檢測相關(guān)基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞收樣后，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。測定濃度后使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件： 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。通過Premier Premier 5.0軟件設(shè)計相關(guān)基因的熒光定量引物，送北京華大基因公司合成。引物序列見表1。

按照AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR,通過2-△△CT方法計算目的基因的相對表達(dá)量變化。

表1 引物序列及作用

1.2.5 Western blotting檢測相關(guān)基因的蛋白表達(dá) 獲取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，計算上樣濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。37 ℃孵育1 h(所有一抗稀釋比例均為1∶3 000)?；厥找豢?，室溫孵育二抗(二抗稀釋比例為1∶30 000)1 h。ECL發(fā)光試劑盒顯色后獲得圖像。

1.2.6 CCK8檢測羊駝黑色素細(xì)胞增殖能力 以每孔2 000個細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8(CCK8)試劑后，分別于0、12、24、36、48、60、72 h在酶標(biāo)儀450 nm處檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.7 Transwell檢測羊駝黑色素細(xì)胞侵襲能力 每孔1×105個細(xì)胞種植于Transwell 24孔板小室中，設(shè)立3個重復(fù)組，培養(yǎng)24 h。取出小室，清除小室內(nèi)側(cè)的細(xì)胞后甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色 30 min，自來水洗滌。顯微鏡觀察遷移細(xì)胞數(shù)，隨機挑選選5個視野計數(shù)，計算細(xì)胞平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實時熒光定量PCR、Western blotting等結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析，并采取Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 miR-146a與MAPK4、Myosin Va靶關(guān)系的驗證

利用miRBase、Targetscan軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MAPK4和MyosinVamRNA存在 miR-146a的潛在靶點(圖1A)。與野生型3′UTR相比，MAPK4-wt+miR-146a組雙熒光素酶活性極顯著降低36%(P<0.001)，而Myosin Va-wt+miR-146a組極顯著降低30%(P<0.001)，突變組的雙熒光素酶活性無明顯變化(圖1B、C)。

2.2 過表達(dá)miR-146a對MAPK4、Myosin Va mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法檢測過表達(dá)miR-146a的羊駝黑色素細(xì)胞中MAPK4、MyosinVa基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146a mimic后，羊駝黑色素細(xì)胞中MAPK4、MyosinVa基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)量比NC組分別極顯著或顯著下調(diào)67% 和47%(P<0.001，P<0.01，圖2A)，蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量分別顯著或極顯著下調(diào)38%和69%(P<0.05；P<0.01，圖2B、2C)。

2.3 過表達(dá)miR-146a對相關(guān)基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

實時熒光定量PCR和免疫印跡蛋白質(zhì)檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-146a后，CREB、MITF、MLPH和Rab27a較NC組mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量均顯著降低(圖3A-C)，其中CREB蛋白質(zhì)水平降低最為顯著，達(dá)70%(P<0.001)，抑制組則相反。在羊駝黑色素細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a使CREB、MITF、MLPH和Rab27a基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)。

2.4 miR-146a對羊駝黑色素細(xì)胞增殖能力的影響

miR-146a mimic轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞后，CCK8試驗用分光光度計(450 nm)分別在0、12、24、36、48、60、72 h檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，miR-146a轉(zhuǎn)染組的OD值在72 h前明顯低于NC組和Inhibitor組(圖4)。

2.5 miR-146a對羊駝黑色素細(xì)胞遷移能力的影響

通過Transwell 小室培養(yǎng)法檢測羊駝黑色素細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示，miR-146a mimic轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞后，穿膜細(xì)胞數(shù)以及遷移能力極顯著低于對照組(P<0.01); 而miR-146a Inhibitor轉(zhuǎn)染黑色素細(xì)胞后，穿膜細(xì)胞數(shù)以及遷移能力極顯著高于對照組(P<0.01，圖5)。

3 討 論

miRNA是重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞分化、增殖和重編程過程中都發(fā)揮至關(guān)重要的作用[24]。在黑色素細(xì)胞中，越來越多的miRNAs參與多個分子通路以調(diào)控黑色素細(xì)胞的生物學(xué)過程[25-26]。miR-146a通過抑制酪氨酸酶家族基因的表達(dá)而對小鼠黑色素細(xì)胞中黑色素的生成起調(diào)控作用[7]。在進(jìn)一步挖掘miR-146a的功能時發(fā)現(xiàn)，MAPK4和MyosinVa是其靶基因，且有關(guān)報道顯示，miR-146a對癌細(xì)胞的增殖有影響[8-9]，因此，miR-146a可能參與羊駝黑色素細(xì)胞的增殖等生物學(xué)過程。

本研究通過雙熒光素報告基因發(fā)現(xiàn)，miR-146a以序列特異性的方式與MAPK4和MyosinVa的3′UTR結(jié)合，在羊駝黑色素細(xì)胞中過表達(dá)miR-146a使MAPK4、MyosinVa基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)量下調(diào)，結(jié)果驗證了羊駝MAPK4和MyosinVa是miR-146a 的靶基因。

MAPK4是MAPK家族的一種絲裂原激活的蛋白激酶，MAPK信號通路參與多種生化級聯(lián)反應(yīng)[12]，將信號由胞內(nèi)傳遞到核內(nèi)開始啟動級聯(lián)反應(yīng)，從而激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步調(diào)控下游MEK1、CREB、MITF等級聯(lián)反應(yīng)通路上重要基因的表達(dá)[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a過表達(dá)使p-MEK1下調(diào)，而MEK1未發(fā)生變化，由此可見，MAPK4通過催化MEK1磷酸化而發(fā)生了級聯(lián)反應(yīng)，通過MITF調(diào)節(jié)參與黑色素合成基因的表達(dá)[28]，而MITF在黑色素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞中的發(fā)育、維持、存活、色素沉積、細(xì)胞浸潤、細(xì)胞周期以及細(xì)胞增殖中起著不可或缺的作用[29]。MITF是很多級聯(lián)反應(yīng)通路重要的樞紐[30-31]，其轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾等不同水平的表達(dá)和功能調(diào)控與MEK路徑密切相關(guān)，抑制MEK可以降低MITF的轉(zhuǎn)錄[32]。MEK路徑激活后可調(diào)節(jié)人黑色素細(xì)胞CREB[33]，本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-146a過表達(dá)可下調(diào)CREB的表達(dá)，CREB是MEK路徑下游的主要調(diào)控因子，可以誘導(dǎo)MITF的表達(dá)[34]。由此可見，miR-146a靶向調(diào)控MAPK4后通過磷酸化MEK1而調(diào)節(jié)CREB，從而抑制MITF的表達(dá)。

在黑色素細(xì)胞中產(chǎn)生的黑色素顆粒需運輸?shù)綐渫患獠?，Myosin Va、Rab27a和MLPH三者形成的三元復(fù)合物在此過程起協(xié)同作用[35]。Rab27a是膜轉(zhuǎn)運的重要調(diào)控因子[36]，Myosin Va需要同時與黑素體上含有Rab27a和MLPH復(fù)合物的多個組分相互作用[37]。然而，還有研究表明，Myosin Va促進(jìn)黑色素瘤黏附、錨定、遷移和體外侵襲，其上調(diào)可能是促進(jìn)腫瘤惡性發(fā)展的機制[38]。結(jié)合本試驗對遷移試驗的結(jié)果分析，在羊駝黑色素細(xì)胞中miR-146a靶向抑制MyosinVa的同時，其復(fù)合物的其他兩個成員Rab27a和MLPH的表達(dá)也受到抑制，說明miR-146a在調(diào)控黑色素細(xì)胞遷移時，Myosin Va可能仍以復(fù)合物的形式發(fā)揮其功能。綜上所述，miR-146a對羊駝黑色素細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控可得出，miR-146a抑制其靶基因MAPK4和MyosinVa的表達(dá)，從而影響MAPK級聯(lián)路徑中重要因子和Myosin Va/Rab27a/MLPH復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控羊駝黑色素細(xì)胞的增殖和遷移能力。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-146a通過靶向調(diào)控MAPK4和MyosinVa，使增殖和遷移相關(guān)基因MEK1、CREB、MITF、MLPH、Rab27a的表達(dá)下調(diào)，從而對羊駝黑色素細(xì)胞的增殖和遷移起抑制作用。