張曉娟，陳 鳳

（玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 玉林537000）

睡安膠囊由酸棗仁（炒）、五味子、遠(yuǎn)志、何首烏藤、丹參、石菖蒲、知母、茯苓、甘草等藥材制成，具有養(yǎng)血安神、清心除煩的功效，對(duì)心煩不寐、怔忡驚悸、夢(mèng)多易醒或久臥不眠有較好的療效［1-2］。目前睡安膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有鑒別項(xiàng)而無含量測(cè)定項(xiàng)目［3］，藥品質(zhì)量控制方法尚不夠完善。據(jù)報(bào)道，由于五味子地理分布不同，其性狀、化學(xué)成分的種類及含量存在著差異［4-6］。為保證藥品療效穩(wěn)定，提高藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文建立了HPLC法對(duì)睡安膠囊中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的含量進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器LC-2030C 3D高效液相色譜儀DAD檢測(cè)器（島津儀器有限公司）；XS-205DU型電子分析天平（梅物勒-托利多儀器有限公司）；SB2200超聲清洗器（上海必能信超聲有限公司）；津騰過濾器（天津津騰實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-201412，含量99.4%）、五味子酯甲對(duì)照品（批號(hào)：1529-200001，含量100%）、五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)：110764-201714，含量99.3%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；五味子醇乙對(duì)照品（批號(hào)：PR160728-14，含量99.31%）購(gòu)于Stanford Chemicals；睡安膠囊（批號(hào)：170613、191203、191118、200103，規(guī)格：每粒裝0.5 g，廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；磷酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，廣東光華科技有限公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用依利特公司Supersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相以乙腈-0.01%磷酸（60∶40），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱定4種對(duì)照品至25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制備成濃度為五味子醇甲0.318 2 mg/ml、五味子醇乙0.448 9 mg/ml、五味子酯甲0.425 6 mg/ml、五味子甲素0.617 5 mg/ml的儲(chǔ)備液；再精密量取五味子醇甲儲(chǔ)備液2.5 ml、五味子醇乙儲(chǔ)備液1.5 ml、五味子酯甲儲(chǔ)備液0.5 ml、五味子甲素儲(chǔ)備液0.5 ml于10 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備［7-10］取睡安膠囊內(nèi)容物2.0 g，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出放冷后，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用濾紙過濾后再用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 按睡安膠囊制備工藝制成缺五味子的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下操作制備陰性樣品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各20μl，按2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。見圖1。結(jié)果陰性溶液在與混合對(duì)照品溶液的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素相同保留時(shí)間上無色譜峰出現(xiàn)，說明陰性溶液對(duì)測(cè)定無干擾。

2.3 線性關(guān)系的考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液1μl、2μl、4μl、8μl、16μl、20μl，按2.1色譜條件進(jìn)行分析，以對(duì)照品溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，回歸方程見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 對(duì)照品的回歸方程及線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素峰面積的RSD分別為0.51%、0.45%、0.39%、0.36%（均n=6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為191203的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素峰面積的RSD分別為0.84%、0.26%、0.24%、1.15%（均n=6），表明供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品5份（批號(hào)：170613），按“2.2.2”項(xiàng)下法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，測(cè)得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的平均含量分別為120.9μg/g、38.2μg/g、20.8μg/g、17.6μg/g，RSD分別為2.71%、1.34%、2.05%、3.39%（均n=5），表明重復(fù)性可滿足分析要求。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號(hào)：170613）9份，分別加入混合對(duì)照品溶液低、中、高3個(gè)濃度，每個(gè)濃度3份，按“2.2.2”法制備供試品溶液，再按2.1色譜條件測(cè)定各成分的含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （n=9）

2.8 含量測(cè)定 取4批睡安膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。依“2.1”色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果 （μg/g）

3 討論

3.1 儀器的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)采用UPLC與HPLC同時(shí)摸索液相條件，通過比較發(fā)現(xiàn)，UPLC分析時(shí)間較快，但因超高壓柱柱長(zhǎng)和內(nèi)徑小，通過梯度洗脫等方法并未能改善供試品的分離度；而采用HPLC等梯度洗脫能較好實(shí)現(xiàn)供試品各特征峰的分離，故選用HPLC。

3.2 色譜柱的選擇 先后使用Thermo Syncronis C18色譜柱、Agilent extend C18色譜柱、Agilent SB C18色譜柱及依利特Supersil ODS2等色譜柱，比較發(fā)現(xiàn)對(duì)于本實(shí)驗(yàn)依利特Supersil ODS2分離效果最好。

3.3 流動(dòng)相的選擇 比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同系統(tǒng)流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸水溶液等梯度洗脫時(shí)峰形、分離度均最佳。

3.4 樣品提取溶劑的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)甲醇、75%甲醇、50%甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水等溶劑進(jìn)行提取效率考察，結(jié)果以75%甲醇提取供試品，目標(biāo)物質(zhì)測(cè)得量最高，且提出的色素等雜質(zhì)也較少。

3.5 樣品提取方法的選擇 選定提取溶劑后，通過比較超聲提取20 min、30 min、45 min，水浴回流提取30 min、45 min、60 min及索式提取等方法的提取效率，結(jié)果顯示超聲提取30 min為最優(yōu)提取方法。

3.6 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器在200～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并采集光譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測(cè)組分在220 nm有較好吸收，基線平整，無雜質(zhì)峰干擾。

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC法同時(shí)測(cè)定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素含量的方法，重現(xiàn)性好，回收率較高，精密度良好，為提高藥品標(biāo)準(zhǔn)和更有效地控制藥品質(zhì)量提供了參考。