張雪丹 ，劉 濤 ，楊娟俠 ，王 丹 ，范 昆 ，張 倩 ，辛 力 ,*

（1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.中華人民共和國黃島海關，山東 青島 266555）

藍莓（Vaccinium corymbosum L.）又名藍漿果、越橘，為杜鵑花科越橘屬植物，其果肉細膩、肉軟多汁、色澤美麗，富含花色苷等營養(yǎng)成分和抗氧化物質，具有很高的營養(yǎng)保健和經(jīng)濟價值[1-2]。雖然藍莓果實pH較低，但因采摘時果蒂部位的傷口易受病菌感染，且采收多在高溫高濕季節(jié)，果實呼吸速率高，導致藍莓果實腐爛而不耐貯藏，20 ℃下貯藏期僅為一周左右，這限制了藍莓跨地域、長時間、高質量的流通和銷售[3-4]。隨著我國藍莓栽培面積的不斷擴大和果實產(chǎn)量的持續(xù)升高，人們對藍莓鮮果采后品質提出了更高的要求，不僅要保持較好的食用品質和較長的保鮮貨架期，還需保證其食用安全性。

咯菌腈（Fludioxonil，F(xiàn)L）是一種低風險的廣譜殺菌劑，屬于苯基吡咯家族，主要抑制灰霉菌和青霉菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)[5]。目前，咯菌腈已成為先正達、拜耳和孟山都等企業(yè)生產(chǎn)的30 多種不同農(nóng)藥的主要成分，獲準應用于900 多種農(nóng)產(chǎn)品上[6]。研究表明，該殺菌劑可顯著降低檸檬[7]、石榴[8]、芒果[9]、櫻桃[10]等果品貯藏保鮮的腐爛率，延長果品貯藏保鮮期的同時保持了果實品質，因此咯菌腈在果品采后貯藏保鮮領域有廣闊的應用前景。但有研究表明，咯菌腈可能會對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響從而影響人類健康[11]，因此各國均對咯菌腈的應用范圍和作用物最大殘留量做出嚴格的規(guī)定。

目前，咯菌腈主要用于藍莓栽培中各種病害的防治上[12-13]，未見有咯菌腈用于藍莓采后貯藏保鮮的研究。本文以“萊格西”（Legacy）藍莓為試材，研究咯菌腈浸泡處理對采后常溫保鮮藍莓的咯菌腈殘留量、腐爛率、失重率、呼吸速率、乙烯生成速率、可溶性固形物、可滴定酸和花青苷含量等的影響，綜合評價咯菌腈用于藍莓采后貯藏保鮮的安全性和可行性，旨在為藍莓采后貯藏保鮮提供新的途徑和理論依據(jù)，為果蔬采后貯藏保鮮提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

藍莓品種為野生藍莓和高灌藍莓的雜交后代“萊格西”（Legacy），采自山東省泰安市岱岳區(qū)方泰旭瑞農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，果園為6 年生標準化藍莓園。2019 年 6 月 24 日早上采摘 8～9 成熟果，當天上午運至實驗室，去除霉爛、蟲害、凹陷、畸形等非商品果，挑選大小、色澤一致的果實備用。

50%咯菌腈（粉劑）：先正達生物科技有限公司產(chǎn)品；乙腈、硫酸鎂、檸檬酸、氯化鉀、乙酸鈉、鹽酸、甲醇等均為分析純，天津市凱通化學試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設備

Agilent1260 高相液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；WY032T 型手持測糖儀，西安精大檢測設備有限公司；F-950 型手持式乙烯測量儀，北京陽光億事達科技有限公司；ML-204 型電子天平，梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；UV-2100 型紫外可見分光光度計，瑞典Amersham Biosciences 公司；5810R型高速離心機，艾本德（上海）國際貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方法

對照（CK）：藍莓在去離子水中浸泡處理10 s，然后撈出瀝干（果面無水分），裝入打孔塑料盒內，每盒200 粒，置于20 ℃恒溫箱內貯藏，共30 個重復。分別于貯藏 0、2、4、6、8 d 取樣，每次取樣 6 盒。

咯菌腈處理（100 mg/kg FL）：果實置于100 mg/kg的咯菌腈溶液中浸泡處理10 s，然后撈出瀝干（果面無水分），裝入打孔塑料盒，每盒200 粒，置于20 ℃恒溫箱內貯藏，共 30 個重復。放置 0、2、4、6、8 d 取樣，每次取樣6 盒。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 咯菌腈殘留量

樣品前處理參考秦富等[14]的方法，并稍有改動。稱取3.0 g 藍莓樣品，加入20 mL 乙腈冰浴研磨，然后加入助劑硫酸鎂（4 g）和檸檬酸（1 g）并混合振蕩30 min。經(jīng)4 000 r/min 離心5 min，取上清液加入無水硫酸鎂和N-丙基乙二胺混勻，再次離心，上清液為制備待測液。色譜柱為C18 柱，波長270 nm，流動相為水和乙腈。

1.2.2.2 腐爛率

果實表面發(fā)生汁液外漏或有肉眼可見腐爛斑點即為腐爛果，統(tǒng)計每盒藍莓的腐爛果數(shù)，根據(jù)下列公式計算腐爛率：

1.2.2.3 失重率

稱取每個保鮮盒內藍莓果實的質量m0，常溫放置2 d 后果實質量為m2，根據(jù)下列公式計算常溫放置2 d 的失重率，以此類推分別稱量并計算保鮮4、6、8 d的果實失重率。

1.2.2.4 呼吸速率和乙烯生成速率

使用F-950 型手持式乙烯測量儀測定密封容器內藍莓果實的呼吸速率和乙烯生成速率[15-16]，其中呼吸速率以每小時每千克藍莓果實產(chǎn)生的CO2量（mg）表示，乙烯生成速率以每小時每千克藍莓果實產(chǎn)生的乙烯體積量（μL）表示。

1.2.2.5 可溶性固形物含量

將藍莓果實打漿并迅速吸取上清液2～3 滴涂在手持測糖儀上，測定可溶性固形物含量。

1.2.2.6 可滴定酸（TA）含量

采用酸堿滴定法測定，稱取10 g 果實用石英砂研磨勻漿并加蒸餾水30 mL 轉移至三角瓶內，過濾；取濾液10 mL，加入3 滴酚酞，用 0.1 mol/L NaOH 滴至溶液微紅轉白色，30 s 不褪色即為滴定終點，記錄消耗的NaOH 用量?？傻味ㄋ岷康挠嬎愎饺缦滤?，以果實中的蘋果酸含量表示。

式中：K 為蘋果酸換算系數(shù) 0.067；A 為消耗NaOH量，mL；C 為稀釋總量；W 為樣品質量，g；D 為測定取樣量，mL。

1.2.2.7 花青素含量

參考Lin 等[17]的雙波長pH 示差法，并稍有改動。稱取3 g 藍莓組織研磨，加入酸性甲醇（0.1% HCl）30 mL，在 45 ℃水浴鍋中提取 45 min，離心（6 000 r/min，10 min），取上清液。沉淀中加入酸性甲醇30 mL，再次提取、離心、合并上清液，重復兩次，提取的3次上清液為花青素粗提液。吸取1 mL 上述提取液，分別加入9 mL 的0.025 mol/L 氯化鉀緩沖液（pH 1.0）和0.4 mol/L 乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）稀釋，平衡15 min，然后分別在 515 nm 和 700 nm 處測定每種稀釋液對蒸餾水的吸光度值。根據(jù)下列公式計算花青素含量，結果以100 g 果實中所含有的矢車菊-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside）的量（mg）表示：

式中：ΔA 為pH 1.0 測試液在波長515 nm 和700 nm處吸光度的差減去pH 4.5 測試液在波長515 nm和700 nm 處吸光度的差；MW 為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2；DF 為稀釋因子；ε 為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，29 600；L 是光程厘米數(shù)，1 cm。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖使用GraphPad Prism 7 軟件，顯著性分析使用SPSS 19.0 軟件。每個處理6 個重復，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 咯菌腈殘留量分析

為評價咯菌腈用于藍莓采后貯藏保鮮的食用安全性，課題組采用HPLC 法對咯菌腈溶液浸泡處理后的藍莓果實咯菌腈殘留量進行了測定。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理10 s 后，藍莓果實中咯菌腈殘留量為（1.91±0.05）mg/kg（圖 1）。

圖1 HPLC 法測定藍莓中的咯菌腈殘留量Fig.1 The determination of fludioxonil residue level in blueberries by HPLC

2.2 咯菌腈處理對藍莓果實腐爛率的影響

腐爛率不僅影響果品的食用品質，還會影響果品的商品價值。為評價咯菌腈處理抑制藍莓腐爛率的效果，開展了腐爛率調查試驗，結果見圖2。在20 ℃貯藏條件下，咯菌腈處理可以降低藍莓腐爛率。常溫放置8 d，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 處理果腐爛率為4.19%±0.53%，極顯著低于對照藍莓果的腐爛率（P＜0.01）。這是因為造成本地藍莓腐爛的主要病菌為灰霉菌[18]，而咯菌腈可以抑制灰霉菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，因此可以有效降低藍莓的腐爛率。

圖2 咯菌腈處理對常溫貯藏期間藍莓果實腐爛率的影響Fig.2 Effect of fludioxonil treatment on decay rates of blueberry fruits during room temperature storage

2.3 咯菌腈處理對藍莓失重率的影響

藍莓果實商品性的喪失主要表現(xiàn)在兩個方面，一是腐爛敗壞，二是失水皺縮[19]。藍莓采后呼吸作用造成有機物質的消耗和水分含量的下降，果實失重率增加。由圖3 可知，藍莓果實的失重率隨貯藏時間的延長逐漸升高，而咯菌腈處理顯著促進了失重率的增加（P＜0.05）。20 ℃貯藏 2 d 時，對照果和 100 mg/kg FL處理果的失重率分別為0.92%±0.06%和1.04%±0.07%；貯藏8 d 時，對照果和100 mg/kg FL 處理果的失重率分別為4.47%±0.24%和4.82%±0.15%。由此可知，咯菌腈處理增加了常溫保鮮藍莓期果實的失重率。

圖3 咯菌腈處理對常溫貯藏期間藍莓果實失重率的影響Fig.3 Effect of fludioxonil treatment on weight lost rates of blueberry fruits during room temperature storage

2.4 咯菌腈處理對藍莓呼吸速率和乙烯生成速率的影響

圖4 咯菌腈處理對常溫貯藏期間藍莓果實呼吸速率的影響Fig.4 Effect of fludioxonil treatment on respiration rate of blueberry fruits during room temperature storage

圖5 咯菌腈處理對常溫貯藏期間藍莓果實乙烯生成速率的影響Fig.5 Effect of fludioxonil treatment on ethylene production rate of blueberry fruits during room temperature storage

由圖4、5 可知，隨著貯藏時間的延長，藍莓果實的呼吸速率和乙烯生成速率逐漸下降，但均保持中等呼吸速率和低乙烯生成速率的特性[20]。雖然100 mg/kg FL 處理果的呼吸速率在常溫保鮮期均高于對照果，但兩者無顯著性差異。與呼吸速率相同，咯菌腈處理果的乙烯生成速率均高于對照果。且在常溫貯藏2 d 時，100 mg/kg FL 處理果的乙烯生成速率顯著高于對照（P＜0.05），即100 mg/kg 咯菌腈處理顯著促進了果實的乙烯生成速率。這種促進作用可以提高藍莓抗病酶的活性，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）等[21]，從而降低果實的腐爛率和衰老程度。

值得注意的是，常溫貯藏期“萊格西”藍莓的呼吸速率和乙烯生成速率的下降趨勢相同，這可能與“萊格西”藍莓屬于高叢藍莓有關，即高叢藍莓的呼吸速率和乙烯含量在成熟期達到峰值，采后貯藏期間逐漸下降[22]。與對照果實相比，咯菌腈處理果實一直保持較高的呼吸速率（CO2生成速率）和乙烯生成速率，這可能是造成咯菌腈處理果實失重率較高的主要原因。

2.5 咯菌腈處理對藍莓可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

果實的可溶性固形物和可滴定酸含量決定了其食用時的口感和可接受程度。由表1 可知，隨著常溫貯藏時間的延長，藍莓的可溶性固形物含量先降低后升高。常溫貯藏8 d 時，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s處理藍莓果實的可溶性固形物含量達到最高，為14.72%±0.14%，但與CK 相比無顯著性差異。藍莓的可滴定酸含量則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但CK和100 mg/kg FL 處理果的可滴定酸含量均無顯著性差異，即100 mg/kg 咯菌腈處理果不會影響藍莓的可滴定酸含量。綜上所述，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 處理不會影響藍莓的食用品質。

表1 常溫貯藏期間藍莓果實可溶性固形物和可滴定酸含量的變化Table 1 The contents of soluble solids and titration acid of blueberries storaged at room temperature

2.6 咯菌腈處理對藍莓花青素含量的影響

藍莓果實富含花青素，具有較強的抗氧化性和較高的保健價值[23]。由圖6 可見，藍莓花青素含量隨著常溫貯藏時間的延長而逐漸升高，貯藏4～8 d，100 mg/kg FL 處理果的花青素含量顯著高于對照（P＜0.05）。常溫貯藏 8 d 時，100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡10 s 處理果的花青素含量為（24.44±0.58）mg/100 g FW，顯著高于對照果（P＜0.05）。

圖6 咯菌腈處理對常溫貯藏期間藍莓果實花青素含量變化的影響Fig.6 Effect of fludioxonil treatment on anthocyanin content of blueberry fruits during room temperature storage

3 討論與結論

前期研究發(fā)現(xiàn)，果實咯菌腈的殘留量與咯菌腈浸泡后的處理方式有很大關系[24-25]。本課題組開展了咯菌腈溶液浸泡后再用水沖洗對咯菌腈殘留量的影響研究。結果表明，藍莓經(jīng)100 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理10 s 后再用水沖洗5 min，咯菌腈的殘留量為（0.76±0.03）mg/kg；藍莓經(jīng) 200 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理20 s 后再用水沖洗5 min 的咯菌腈殘留量為（0.82±0.03）mg/kg。由此可知，藍莓經(jīng)咯菌腈溶液浸泡后再用水沖洗5 min 則可大大降低咯菌腈的殘留量。值得注意的是，雖然用水沖洗可以降低藍莓咯菌腈殘留量，但處理的藍莓腐爛率快速升高，因此不建議生產(chǎn)上先用高濃度咯菌腈溶液浸泡藍莓后再用水沖洗藍莓。

另外，咯菌腈殘留量還與咯菌腈的品質狀態(tài)有關，本試驗中的咯菌腈為先正達公司生產(chǎn)的粉劑殺菌劑，200 mg/kg 咯菌腈溶液浸泡處理20 s 后咯菌腈殘留量為（2.97±0.16）mg/kg。而用另外一家公司生產(chǎn)的咯菌腈懸浮劑（50%）開展相同試驗時，藍莓中咯菌腈殘留量為（6.63±0.39）mg/kg，且此處理的果實再用水沖洗5 min 后咯菌腈的殘留量為（1.84±0.15）mg/kg。

國際上有多個國家允許咯菌腈用于果蔬采后貯藏保鮮領域，但對其用于藍莓的最大殘留量標準較少，僅有澳大利亞新西蘭食品標準委員會2013 年將藍莓中咯菌腈的最大殘留量調整為1.0 mg/kg，低于其在鱗莖類蔬菜和鱷梨上的最大殘留量[26]。美國、澳大利亞和新西蘭規(guī)定核果類（桃、櫻桃、杏等）中咯菌腈的最大殘留量為5.0 mg/kg；加拿大規(guī)定葉菜類中咯菌腈的最大殘留量為30 mg/kg，西紅柿為5.0 mg/kg，豆類為0.4 mg/kg。2019 年5 月歐盟食品安全局擬將茴香中咯菌腈的最大殘留量調整為1.5 mg/kg[27]。我國自 2020 年 2 月 15 日起實施的 GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[28]規(guī)定，藍莓果實中咯菌腈的最大殘留量為2.0 mg/kg，核果類水果的最大殘留量為5.0 mg/kg。綜合咯菌腈用于藍莓采后處理的殘留量結果，為保證果實的安全食用，建議咯菌腈用于藍莓采后保鮮的處理濃度不高于100 mg/kg。

本試驗以“萊格西”（Legacy）藍莓為試材，研究咯菌腈浸泡處理對常溫保鮮藍莓的咯菌腈殘留量、腐爛率、失重率、呼吸速率、乙烯生成速率、可溶性固形物、可滴定酸和花青素含量的影響。結果表明，采用100 mg/kg 咯菌腈浸泡10 s 的藍莓果實咯菌腈殘留量為（1.91±0.05）mg/kg，符合 GB 2763—2019 對于藍莓咯菌腈的最大殘留量標準。另外，該處理還顯著降低了藍莓果實的腐爛率，提高了果實的呼吸速率和乙烯生成速率，后期保持較高的可溶性固形物含量，并促進花青素的生成，但同時也促進了果實失水，具有較高的失重率。綜上所述，100 mg/kg 咯菌腈浸泡10 s 處理藍莓果實不僅可以使其殘留量保持在較低水平，還具有降低藍莓腐爛率和保持果實品質的作用。