梅凱 舒鵬 張松 謝紅意
急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia,AML)是一種異質性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤,不同基因型AML患者對治療反應和預后差異極大[1],約有20%~30%患者存在著內部串聯重復的突變,使得具有酪氨酸激酶活性的原癌基因FMS樣酪氨酸激酶3基因(FLT3)異常激活,并影響患者預后。研究發(fā)現使用FLT3抑制劑治療AML的療效較好[2]。因此如何找出AML患者中預后相關基因,并進行相應的驗證成為研究熱點。目前已有多項研究發(fā)現AML預后相關基因,Li等[3]通過對499例AML患者基因表達數據與臨床資料進行單因素Cox回歸分析,得到24個與患者總體生存率顯著相關的基因。Torrebadell等[4]先對40例造血干細胞移植后AML患者基因表達數據進行分析,得到187個疾病復發(fā)相關基因后,使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)驗證得到BAALC、MN1、SPARC與HOPX基因。盡管如此,在得到預后、治療反應性相關的基因后,對于這些基因在腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展中具體機制的研究則相對較少。本研究采用Cox回歸模型得到預后相關基因,并分析這些基因表達與患者總體生存率之間的關系,同時進行相應的機制探討,現報道如下。
1.1 對象 收集2013年4月至2017年6月寧波市北侖區(qū)人民醫(yī)院收治30例AML患者初治時的骨髓單個核細胞,患者中男21例,女9例,平均年齡(42.93±25.86)歲。所有患者經細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學(MICM)分型標準確診。排除標準:合并糖尿病、心腦血管疾病、重要臟器功能異常、感染性疾病或是不配合本實驗流程。收集2015年5月至2017年12月寧波大學醫(yī)學院生物樣本庫10例健康志愿者的骨髓單個核細胞,健康志愿者中男6例,女4例,平均年齡(37.48±12.19)歲。排除標準:合并有糖尿病、心腦血管疾病等,或是基本資料不完整者。本研究經本院醫(yī)學倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書。
1.2 試劑及儀器 人急性單核細胞白血病細胞系AML-193購自國家實驗細胞資源共享平臺,包裝病毒用293t細胞由本室保藏。IMDM培養(yǎng)基(12440079)、胎 FBS(10438026)、胰島素(12585014)、轉鐵蛋白(T13342)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(PHC2013)均購自美國Gibico公司。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA慢病毒載體購自美國Sigma公司,慢病毒包裝載體 PMD2.G(12259)、psPAX2(12260)均購自美國 Addgene公司。Lipofectamine 2000(12566014)購自美國ThermoFisher公司,PEG慢病毒純化試劑(LV810A-1)購自美國SBI公司。Western blot檢測中RIPA強裂解液(P0013B)購自上海碧云天公司,HECTD3(ab173122)抗體購自美國 Abcam 公司,ubiquitin(3933)、NF-κB 通路p65(8242)、p-p65(3033)、IKBα(5206)、p-IKBα(2859)、內參抗體GAPDH(5174)均購自美國Cell Signaling Technology公司。RT-PCR+qPCR實驗中Trizol(15596026)購自美國ThermoFisher公司,反轉錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A)與 SYBR 檢測試劑盒 SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNase H Plus)(RR820A)均購自北京寶日醫(yī)生物技術有限公司,實驗中全部引物均由深圳華大基因股份有限公司合成。細胞增殖檢測中CCK-8試劑盒(CK04)購自日本同仁化學研究所,細胞凋亡Annexin V別藻藍蛋白(Allophycocyanin,APC)/碘化丙碇(PI)雙染試劑盒(A02001-11PG)購自天津三箭生物技術有限公司。細胞周期檢測中高濃度PI購自美國Sigma公司(P4170)。凝膠遷移(EMSA)實驗中生物標記的 NF-κB(GS056B)、OCT-1(GS061B)探針購自上海碧云天公司,核蛋白提取試劑盒(C500009-0050)購自上海生工生物工程有限公司,化學發(fā)光法EMSA試劑盒(GS009)購自上海碧云天公司。
1.3 細胞培養(yǎng)與分組 AML-193細胞系使用IMDM+5% FBS+5 μg/ml胰島素+5 μg/ml轉鐵蛋白+5 ng/ml粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。在得到HECTD3-scramble與 HECTD3-shRNA慢病毒后,AML-193細胞分為HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA組,分別感染HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA慢病毒,感染復數(病毒/細胞的比值)為10 MOI。
1.4 慢病毒包裝與純化 HECTD3功能驗證使用shRNA敲低的方法。HECTD3-scramble(對照載體)與HECTD3-shRNA載體首先包裝為慢病毒,使用第三代慢病毒包裝體系,包裝步驟:(1)PMD2.G、psPAX2、目的載體分別取 3、9、12 μg 后,使用 lipofectamine 2000 轉入 293t細胞中;(2)收集 36、48、72 h 時含有病毒的培養(yǎng)上清液,并將此上清液與PEG按照體積比4∶1混合,4℃沉淀過夜;(3)所得慢病毒沉淀使用無血清DMEM重懸即得到純化后的慢病毒,使用純化后的慢病毒感染293t細胞,并采用流式細胞儀檢測綠色熒光陽性的細胞比例(感染效率)以判定感染滴度。
1.5 蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA組細胞在感染慢病毒48 h后,使用RIPA裂解液冰上裂解30 min,12 000 r/min,15 min后取上清液,并加入上樣緩沖液,沸水浴15 min。隨后取20 μg蛋白樣本加入預制膠中,50 V恒壓電泳,待marker在分離膠與積層膠界限分開時,120 V恒壓直至溴酚藍跑至分離膠底部,使用濕法轉膜將蛋白轉至PVDF膜后,5%BSA封閉2 h,標記HECTD3、ubiquitin、p65、p-p65、IKBα、p-IKBα、GAPDH一抗過夜,并標記相應種屬的二抗30 min。4℃過夜后,室溫標記相應二抗30 min,使用ECL發(fā)光液檢測蛋白的表達水平。
1.6 不同基因mRNA水平表達的檢測 采用RTPCR+qPCR檢測。細胞總RNA首先使用TRI-ZOL法提取,并使用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,反轉錄步驟:(1)gDNA Eraser Buffer+gDNA Eraser+Total RNA+H2O按照相應比例混合后,42℃2 min;(2)第一步反應混合液+PrimeScript RT Enzyme Mix I+RT Primer Mix+PrimeScript Buffer 2+H2O按照相應比例混合后,37℃15 min,85℃5 s即得到cDNA文庫。隨后以GAPDH為內參,SYBR染料法檢測mRNA表達水平的變化,15個基因qPCR引物序列如下Pla2g4a-F:ACGGTTCAGCATGGCACTGT,Pla2g4a-R:CCACCACAGGCACATCACGT,Tubg2-F:GAGGAGATGCACAGATCGAGG,Tubg2-R:GGACTGTGCTTCTTGTCCAGG,SPON1-F:CATGGTCCGAGTGGAGTGAC,SPON1-R:AGTCAATGGGGCATTCAGGG,TXLNB-F:AAAGCAACGAGGTGTTTGCC,TXLNB-R:GCTGGGCCTCTTTGAGTCTT,KIR3DL1-F:CCAGGTCCCCTGGTGAAATC,KIR3DL1-R:AAATTGGCCTTGGAGACCCC,SDHA-F:AACACTGGAGGAAGCACACC,SDHA-R:AGTAGGAGCGGATAGCAGGA,KIAA0-125-F:AGGACACTGACTTTGGCTAGGG,KIAA0125-R:TCACAGTGCTGTCCAGACCCAT,FAM83G-F:GCCCGCTCGATTGCTCA,FAM83G-R:CCAGACACTGCACCTGAGAG,ACOT7-F:CTAGCCACCATGGCTTTCCA,ACOT7-R:GAGACAGGAAGTCGGTGCG,ARPC5L-F:TCCTGGGGCTGTATAGGGAA,ARPC5L-R:TGTCCGCCACGTAACAGAAG,SLC2A5-F:GGCTTCTCCATCTGCCTCATAG,SLC2A5-R:GGAGATGACACAGACGATGCTG,SOCS1-F:TTCGCCCTTAGCGTGAAGATGG,SOCS1-R:TAGTGCTCCAGCAGCTCGAAGA,ATP13A2-F:GTTATCCAGGCTCTGCGAAGGA,ATP13A2-R:GTGGACGATGATCAGATGCTCC,CALCRL-F:TGGATGGCTCTGCTGGAACGAT,CALCRL-R:CCAGTTTCCATCTTGGTCACAGA,HECTD3-F:ATCGAGATCCGCATCGTGGAGT,HECTD3-R:TAGTTGGCTGGAACAGGTCTGC,內參基因GAPDH-F:GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG,GAPDH-R:ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA,反應體系與條件按照SYBR qPCR試劑盒說明書進行,mRNA的相對表達量采用 2-ΔΔCT表示。
1.7 細胞增殖檢測 采用CCK-8法。首先將HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細胞鋪于96孔板中,并設立0、24、48、72、96 h時間點,每一時間點設立4副孔,每孔3 000個細胞,加入十分之一體積的CCK-8試劑后,37℃孵育3 h,并使用酶標儀檢測光密度(optical density,OD)450 nm的值,細胞增殖指數即為細胞OD 450 nm值與細胞在0 h時OD 450 nm值的比值。
1.8 細胞凋亡檢測 采用Annexin V APC/PI雙染法。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細胞在感染病毒48 h后,使用PBS洗2次,并使用100 μl binding buffer重懸,加入5 μl Annexin V APC抗體與5 μl PI染料,冰上孵育10 min后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化,實驗重復3次。
1.9 細胞周期檢測 采用高濃度PI染色法。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細胞在感染病毒48 h后,使用PBS洗2次,加入700 μl無水乙醇與300 μl PBS+5% FBS重懸,-20℃固定過夜后,加入終濃度為1 μg/ml RNA酶,37℃水浴30 min后,加入終濃度為50 μg/ml PI染料,室溫避光標記30 min后,流式細胞儀檢測細胞周期的變化。
1.10 NF-κB轉錄活性變化的檢測 采用EMSA檢測。HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細胞在感染病毒48 h后,使用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白:(1)使用300 μl預冷 Hypotonic Buffer裂解 10 s,3 000 r/min 離心 5 min;(2)加入 400 μl預冷 Hypotonic Buffer裂解 30 s,500 r/min 離心 5 min;(3)200 μl lysis buffer裂解 20 min后,1 500 r/min 10 min,即得到裂解后的細胞核蛋白,隨后使用NF-κB探針、OCT-1探針進行結合,在EMSA膠中進行分離、紫外交聯,最后使用ECL發(fā)光液檢測NF-κB探針的強度與OCT-1探針強度的比值,并以該比值表示NF-κB的轉錄活性。
1.11 公共數據庫分析 采用R語言進行數據庫分析,具體如下:(1)獲得癌癥基因組圖譜(TCGA)AML患者基因表達數據與相應的臨床信息(http://gdac.broadinstitute.org/);(2)去除RSEM值在60%樣本中表達量低于3的基因;(3)使用limma包中VOOM功能對表達數據進行標準化;(4)計算 z值;(5)使用 caret包將原始數據集按照0.8的比例分為訓練數據集與驗證數據集;(6)使用survival包中的單因素Cox回歸模型在訓練數據集中得到P<0.0001的基因;(7)使用randomForest包對基因進行特征重要性排序,隨機森林算法參數為nodesize=2、ntree=10 000、mtry=571、sampletype=swor、nsplit=10,在選取排名前15個基因后,使用多因素Cox回歸模型計算;(8)將得到的基因在測試數據集中驗證。
1.12 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件,計量資料以表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。采用Cox回歸模型得到患者預后相關基因。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 預后相關基因 首先調取TCGA中173例AML患者的基因表達數據與臨床信息,并按照4∶1的比例分為訓練數據集與測試數據集,經單因素Cox回歸模型得到116個預后相關的基因后,使用隨機森林算法對116個基因與患者生存率之間的關聯程度進行排序;將訓練數據集中樹的數量提高到10 000后,算法在測試數據集中的錯誤率逐漸降低(圖1a、b),通過重要性排序,初步明確了116個基因與患者總體生存率關聯程度(圖1c,見插頁),并最終選擇前15個與患者總體生存率相關的風險基因(表1),使用多因素Cox回歸模型計算預后指數,結果表明在訓練數據集與測試數據集中,高風險患者生存率顯著低于低風險患者(圖1d);在AML患者和健康志愿者骨髓單個核細胞中測定上述15個基因表達水平,qPCR顯示以上15種基因均高表達于AML患者骨髓單個核細胞(圖1e,見插頁)。
表1 15個預后相關基因與患者總體生存率之間的關系
圖1 Cox回歸模型得到15個預后相關的基因(a:使用Cox回歸模型篩選預后相關基因流程;b:檢測不同數量的樹中,隨機森林算法判定分類結果的錯誤率變化,并待錯誤率穩(wěn)定后,使用該數量的樹進行后續(xù)實驗;d:得到15個預后相關基因在訓練與驗證數據集中對患者總體生存率的影響)
圖1 Cox回歸模型得到15個預后相關的基因[a:使用Cox回歸模型篩選預后相關基因流程;b:檢測不同數量的樹中,隨機森林算法判定分類結果的錯誤率變化,并待錯誤率穩(wěn)定后,使用該數量的樹進行后續(xù)實驗;c:使用隨機森林算法對單因素Cox回歸分析得到的116個基因進行重要性排序(顯示前52個基因);d:得到15個預后相關基因在訓練與驗證數據集中對患者總體生存率的影響;e:健康志愿者與AML患者骨髓單個核細胞經qPCR檢測15個預后相關基因在mRNA水平的相對表達量]
2.2 15個預后相關基因的表達與驗證 結果表明HECTD3在健康志愿者、AML患者骨髓單個核細胞中表達水平分別為1.00±0.10、5.83±0.24,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001),HECTD3在15個基因中的相對表達量最高,而在GSE12417中,HECTD3的高表達與患者總體生存率顯著相關(圖2a,見插頁)。HECTD3-shRNA在10 MOI下對AML-193具有很好的感染效率(圖2b,見插頁)。在使用qPCR與Western blot檢測HECTD3在mRNA與蛋白水平的變化后,HECTD3-scramble組與HECTD3-shRNA組HECTD3 mRNA相對表達量分別為1.00±0.12、0.23±0.07,HECTD3-shRNA 降低了 HECTD3蛋白水平的表達(圖2c,見插頁)。
圖2 15個預后相關基因的篩選與驗證(a:HECTD3基因在GSE12417數據集中與患者總體生存率之間的關聯;b:使用HECTD3-shRNA慢病毒感染AML-193細胞,感染病毒48 h后,利用流式細胞儀檢測GFP+細胞比例的變化;c:HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA感染AML-193細胞48 h后,Western blot檢測HECTD3在蛋白水平表達的變化)
2.3 HECTD3的表達對AML-193細胞增殖、凋亡與細胞周期的影響 在確定HECTD3-shRNA具有很好的感染與敲除效率后,使用CCK-8檢測HECTD3敲低后細胞增殖的改變,結果表明HECTD3-scramble組與HECTD3-shRNA組在72 h時增殖指數分別為5.41±0.21、3.34±0.18,HECTD3-scramble組顯著高于 HECTD3-shRNA,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),其余各時點比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),見表2。在細胞凋亡中,HECTD3-scramble組與HECTD3-shRNA組ANNEXIN V+比例分別為 4.21±1.38、28.64±5.89,HECTD3-shRNA顯著高于HECTD3-scramble組(P<0.001),在細胞周期中,HECTD3-scramble組與 HECTD3-shRNA組 G1期細胞比例分別為 30.56±5.61、51.61±6.12,HECTD3-shRNA組顯著高于HECTD3-scramble組(P<0.001)。見圖3(插頁)。
表2 兩組細胞增殖指數的比較
圖3 HECTD3的表達對AML-193細胞增殖、凋亡與細胞周期的影響(a:使用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡的變化;b:使用高濃度PI染色法檢測細胞周期的變化)
2.4 HECTD3-shRNA對AML-193中NF-κB通路活性的影響 與HECTD3-scramble組比較,HECTD3-shRNA組泛素結合蛋白比例顯著降低,灰度值分別為7.91±1.68與 3.72±1.35,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。HECTD3-shRNA組p65磷酸化顯著降低,p65表達量并無明顯改變,抑制因子IKBα磷酸化水平降低,同時表達量升高;HECTD3-scramble組、HECTD3-shRNA組 NF-κB探針與OCT-1探針灰度值的比值分別為1.4±0.15、1.03±0.12,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),表明HECTD3-shRNA組NF-κB轉錄活性顯著降低。見圖4。
圖4 HECTD3-shRNA顯著抑制AML-193中NF-κB通路的活性(a:總泛素結合蛋白的變化;b:NF-κB通路p65磷酸化、總p65、抑制因子IKBα磷酸化、總IKBα的改變;c:NF-κB轉錄活性的改變)
AML是一種以骨髓性造血芽細胞異常增殖為特征的惡性腫瘤,可依據FAB分類分為M0~M7 8種亞型,目前是成人急性白血病中較常見的一種[5]。AML的預后與患者的細胞遺傳學、白血病細胞的染色體結構顯著相關,如在-5,-7,del(5q)型別患者中,預后顯著變差,特定的基因異常激活如FLT3、c-KIT、VEGFR等同樣能夠顯著影響患者預后[6],應用特異的激酶抑制劑如midostaurin能夠在特定的基因型患者中得到很好的效果[7]。因此尋找與患者預后相關的基因,并進行特定的靶向治療具有很好的前景。
在本研究中,首先使用單因素Cox回歸模型得到116個與患者總體生存率顯著相關的基因,對于臨床決策與進一步的實驗驗證而言,116個基因數量過龐大,而隨機森林能夠通過對平均不純度的衰竭來對特征的重要性進行排序,且能夠通過加權表決的方式避免決策樹中常見的過擬合問題[8]。隨后使用隨機森林對基因表達重要性進行排序,最終得到基于15個在訓練、測試數據集中均有很好的表現的預后相關基因。在與現有預后相關標志物進行比較后,結果表明該15個預后基因與Li Z、Torrebadell的預后基因無任何重疊,本研究健康志愿者與AML患者骨髓單個核細胞中,HECTD3基因表達水平為15個基因中最高,同時HECTD3作為泛素E3結合酶[9],與其具有相似功能的WWP1[10]、FBXO9[11]、RNF5[12]、TRAF2[13]均被證實與 AML發(fā)病相關,盡管HECTD3目前與血液系統(tǒng)腫瘤之間的關系尚未有報道,HECTD3已被證實在乳腺癌中高表達[9],在食管鱗狀細胞癌中,HECTD3特異性的促進Caspase9的泛素化,進而抑制了Caspase9與Apaf-1的結合,從而促進了食管癌細胞體內與體外的增殖[14]。在AML-193 HECTD3-scramble與HECTD3-shRNA細胞系中,感染病毒72 h時,HECTD3-shRNA組細胞增殖指數顯著低于HECTD3-scramble,HECTD3-shRNA同時使得AML-193細胞凋亡比例增加、細胞周期中G1期細胞比例增加,證實了HECTD3對于維持細胞生存至關重要,可作為靶向治療的靶點。
基于HECTD3的功能,首先使用ubiquitin抗體檢測細胞泛素結合蛋白的變化,結果表明HECTD3的敲低使得泛素結合蛋白比例下降,而在之前的研究中,泛素結合蛋白比例的下降能夠誘導NF-κB通路的抑制[15],而NF-κB同時也是AML發(fā)生、發(fā)展中重要的蛋白[16],HECTD3的抑制則使得p65磷酸化降低、IKBα磷酸化首先,總IKBα表達顯著升高,HECTD3的抑制還使得NF-κB探針的信號強度降低,論證了HECTD3對NF-κB通路的維持作用,而HECTD3對AML細胞的作用則可能與NF-κB通路的改變。
綜上所述,本研究使用了Cox回歸模型、隨機森林相結合的方式,鑒定出預后相關的基因,并進行了簡單的功能、機制驗證,為進一步小分子抑制劑的開發(fā)提供了實驗基礎。