吳聯(lián)朋 朱守寬 毛婷婷 李煥錚 唐少華

目前，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測(cè)是診斷新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在假陰性等問(wèn)題。隨著對(duì)SARS-CoV-2研究的深入，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》[1]中提出應(yīng)用SARS-CoV-2抗體檢測(cè)可作為COVID-19的輔助診斷。本研究采用化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescent immunoassay,CLIA）檢測(cè)SARSCoV-2的IgM和IgG抗體，評(píng)估其在COVID-19輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2020年1月31日至3月16日溫州市中心醫(yī)院收治的COVID-19住院患者66例（陽(yáng)性組），其中男 33例，女 33例，平均年齡（46.65±14.28）歲。根據(jù)臨床診斷和SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性確診為COVID-19。選取同期本院根據(jù)臨床診斷和SARS-CoV-2核酸檢測(cè)排除COVID-19的發(fā)熱患者50例（對(duì)照組），其中男25例，女25例，平均年齡（43.80±16.37）歲。兩組患者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：L2020-01-059），且所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器 iFlash3000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及其配套的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（深圳亞輝龍生物科技股份有限公司，批號(hào)：20200202），磁珠法核酸提取試劑盒（寧波海爾施基因科技公司，批號(hào)：200129001），SARS-CoV-2ORF1ab/N基因雙重核酸檢測(cè)試劑盒（上海伯杰醫(yī)療科技有限公司批號(hào)：20200125E），全自動(dòng)核酸提取儀（臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司），7500型熒光PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.3 標(biāo)本采集 采集兩組患者清晨空腹靜脈血3～5 ml，置于含分離膠的紅蓋真空采血管內(nèi)，靜置待血液凝固后，2 500 g離心5 min，排除溶血、脂濁等因素的干擾后取血清備用，其中66例陽(yáng)性患者不同病程血清樣本179份，50例陰性患者血清樣本50份。同時(shí)采集兩組患者鼻咽拭子或深部咳痰標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。

1.4 CLIA檢測(cè) 血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測(cè)采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，檢測(cè)步驟參照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，測(cè)試結(jié)果以相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（relative light unit,RLU）表示。樣本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體量和RLU之間呈正相關(guān)，測(cè)定儀根據(jù)RLU及內(nèi)置校準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體濃度（AU/ml），以檢測(cè)結(jié)果≥10.0 AU/ml為有反應(yīng)性（陽(yáng)性），＜10.0 AU/ml為無(wú)反應(yīng)性（陰性）。

1.5 SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 采用熒光RT-PCR技術(shù)，針對(duì)SARS-CoV-2基因組中開(kāi)放讀碼框1ab（open reading frame 1ab,ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein,N）按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。靶基因檢測(cè)判讀和SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性判讀以廠家說(shuō)明書(shū)建議為準(zhǔn)，對(duì)可疑結(jié)果通知臨床重新采樣復(fù)查。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果確診為陽(yáng)性需滿足同一份標(biāo)本中SARSCoV-2的ORF1ab及N基因檢測(cè)同時(shí)陽(yáng)性，或同一患者不同的兩份標(biāo)本中SARS-CoV-2的ORF1ab或N基因檢測(cè)陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)算CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM抗體、IgG抗體以及兩者聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。統(tǒng)計(jì)不同病程IgM、IgG和兩者聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率（用樣本采集日期減去癥狀出現(xiàn)日期得到患者的發(fā)病天數(shù)），采用Excel 2016軟件對(duì)發(fā)病天數(shù)、IgM、IgG和兩者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2抗體結(jié)果分析 SARSCoV-2 IgM抗體檢測(cè)靈敏度為57.54%（103/179），特異度為 92.00%（46/50），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為 92.26%（103/107）,陰性預(yù)測(cè)值為37.70%（46/122），符合率為65.07%（149/229）。SARS-CoV-2 IgG抗體檢測(cè)靈敏度為88.27%（158/179），特異度為96.00%（48/50），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為98.75%（158/160），陰性預(yù)測(cè)值 69.57%（48/69），符合率為89.96%（206/229）。SARS-CoV-2 IgM聯(lián)合IgG抗體檢測(cè)靈敏度為88.83%（159/179），特異度為88.00%（44/50），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為96.36%（159/165），陰性預(yù)測(cè)值68.75%（44/64），符合率為 88.65%（203/229）。見(jiàn)表 1。

表1 CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2抗體結(jié)果分析（份）

2.2 不同病程SARS-CoV-2抗體檢測(cè)結(jié)果分析 將66例確診COVID-19患者的179份血清樣本按病程分為 0～7 d、8～14 d、15～21 d、22～28 d、29～35 d、36～42 d、＞42 d 7個(gè)組，CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM、IgG、聯(lián)合檢測(cè)IgM和IgG抗體的陽(yáng)性率見(jiàn)表2。IgM抗體從發(fā)病的0～7 d開(kāi)始檢出，隨著病程的進(jìn)展陽(yáng)性率逐漸升高，在22～28 d到達(dá)峰值，檢出率為90.91%，此后陽(yáng)性率逐漸下降，＞42 d后陽(yáng)性率下降至23.32%。IgG抗體同樣也在0～7 d開(kāi)始檢出，在22～28d到達(dá)峰值，檢出率達(dá)到100%。不同于IgM抗體，IgG抗體陽(yáng)性率在病程的29～35 d、36～42 d、＞42 d 依舊保持在較高水平。IgM 和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率和單獨(dú)檢測(cè)IgG相仿。

表2 不同病程SARS-CoV-2抗體檢測(cè)結(jié)果分析[份（%）]

3 討論

SARS-CoV-2是一種新型β屬冠狀病毒，屬正冠狀病毒亞科，是繼SARS-CoV和 MERS-CoV等6種冠狀病毒之后，可以感染人類(lèi)的第7種冠狀病毒[2-5]。

2020年1月20日，中國(guó)疾病控制中心（CDC）宣布將該病納入國(guó)家“乙類(lèi)”傳染病，采取“甲類(lèi)”傳染病防控措施。對(duì)疑似患者及時(shí)準(zhǔn)確地診斷，盡早隔離收治，是防控的重要環(huán)節(jié)。目前，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)是診斷COVID-19的常用方法和金標(biāo)準(zhǔn)，但是SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果為假陰性的情況不斷地被提及，這其中與樣本采集的質(zhì)量，病毒RNA易降解，標(biāo)本的前處理方式方法、病毒存在變異、核酸試劑盒本身質(zhì)量問(wèn)題等因素相關(guān)[6]。隨著對(duì)SARS-CoV-2認(rèn)識(shí)和探索的不斷深入，血清抗體檢測(cè)已經(jīng)成為COVID-19的一種輔助診斷方式。

目前，中國(guó)有多家試劑廠家研發(fā)出針對(duì)SARSCoV-2 IgM和IgG抗體的免疫檢測(cè)試劑盒，其中包括膠體金法和CLIA。而CLIA具有靈敏度高、線性范圍寬、高通量、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)普及到對(duì)人類(lèi)免疫缺陷病毒、梅毒等病原體抗體的臨床檢測(cè)當(dāng)中[7]。SARSCoV-2是一種全新的病毒，且體外抗體檢測(cè)不可避免地存在假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題，所以CLIA的檢測(cè)靈敏度和特異度有必要進(jìn)行充分驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的靈敏度、特異度分別為57.54%、92.00%，檢測(cè)IgG抗體診斷COVID-19的靈敏度、特異度分別為88.27%、96.00%，和徐萬(wàn)洲等[6]研究結(jié)果相接近，提示了CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2抗體在診斷COVID-19方面有良好的靈敏度和特異度，且重復(fù)性較好。

當(dāng)病原體感染人體后，人體免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)病原體進(jìn)行免疫防御并產(chǎn)生特異性抗體。IgM抗體通常在1周內(nèi)產(chǎn)生，提示有近期感染。IgG抗體晚于IgM抗體出現(xiàn)，但由于在體內(nèi)能存在較長(zhǎng)時(shí)間，檢測(cè)可鑒別急性感染和既往感染[8]。本研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體從發(fā)病的0～7 d開(kāi)始產(chǎn)生，隨著病程的進(jìn)展陽(yáng)性率逐漸升高，在22～28 d到達(dá)峰值，檢出率達(dá)90.91%，此后陽(yáng)性率逐漸下降，在36～42 d還保持53.85%的陽(yáng)性率，超過(guò)42 d后則下降至23.32%，說(shuō)明部分患者超過(guò)6周后體內(nèi)IgM抗體還存在，具體IgM抗體多久會(huì)消失則需要更長(zhǎng)時(shí)間的隨訪檢測(cè)。IgG抗體同樣也在0～7 d開(kāi)始檢出，在22～28 d到達(dá)峰值，檢出率達(dá)到100%，直至42 d依舊保持著94.59%的陽(yáng)性率，說(shuō)明了SARS-CoV-2 IgG抗體在體內(nèi)存在更久，但滴度是否逐漸降低則需要更多檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證。本研究中IgG抗體陽(yáng)性率全程大于IgM抗體，在病程的中后期不難理解，但在病程早期的0～7 d同樣是IgG大于IgM，或許和檢測(cè)方法本身的靈敏度相關(guān)。

CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體只需110 μl血清標(biāo)本，標(biāo)本較為容易獲得，同時(shí)操作較為簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、設(shè)施等要求比PCR實(shí)驗(yàn)室低，實(shí)驗(yàn)室人員面對(duì)的風(fēng)險(xiǎn)較核酸檢測(cè)低，從上機(jī)檢測(cè)到出結(jié)果需要大約40 min，可作為疑似患者核酸檢測(cè)陰性時(shí)的一種補(bǔ)充檢測(cè)，或與核酸檢測(cè)協(xié)同使用診斷疑似SARSCoV-2感染者[9]。CLIA又是一種定量的檢測(cè)技術(shù)，相比核酸檢測(cè)與膠體金法抗體檢測(cè)等定性方法，可以數(shù)字化更直觀地呈現(xiàn)患者體內(nèi)抗體的濃度，不僅可以輔助診斷COVID-19，對(duì)患者的治療效果監(jiān)測(cè)和病程預(yù)后評(píng)估有重要的提示作用。

綜上所述，CLIA檢測(cè)SARS-CoV-2抗體具有良好的靈敏度和特異度，在病程的22～28 d檢測(cè)陽(yáng)性率最高，該方法簡(jiǎn)便、快捷，對(duì)COVID-19有輔助診斷價(jià)值。