呂威 王鶴丹 苑春麗

牙周組織的修復(fù)與再生的相關(guān)研究一直都是口腔領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-2]。人牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是一類具有干性和成骨分化的潛能的多功能干細(xì)胞，是牙周骨缺損修復(fù)的重要細(xì)胞群，同時(shí)其易于分離與培養(yǎng)，是牙周骨再生最可靠的細(xì)胞來源[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)牙周炎會(huì)激活經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，進(jìn)而下調(diào)成骨相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)(包括ALP、OCN以及Runx2等)，抑制PDLCs的成骨分化能力。

姜黃素是一種從姜科、天南星科植物的根莖中提取的一種二酮類化合物，易溶于有機(jī)溶劑，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能顯著下調(diào)Wnt通路相關(guān)蛋白質(zhì)β-catenin的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌的進(jìn)展。近年來，越來越多的研究表明，姜黃素的抗腫瘤作用是通過抑制Wnt相關(guān)信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的[6-8]，包括宮頸癌和肺癌等，但是關(guān)于姜黃素能否也通過調(diào)控Wnt通路來改善人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力尚不明確。本研究探索了姜黃素對(duì)人牙周膜干細(xì)胞增殖能力及成骨分化能力的影響，并進(jìn)一步闡明其具體的作用機(jī)制，以期望為牙周骨缺損修復(fù)的治療開辟新道路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Amresco公司，美國)；L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素(Gibco公司，美國)；α-MEM培養(yǎng)液；qPCR RT Master Mix、SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(Takara公司，日本)；堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成); 紫外線分光光度儀(Ep- pendorf，德國); CO2孵箱(Heraeus，德國)。

1.2 PDLSCs 分離和培養(yǎng)

收集因正畸減數(shù)或阻生新鮮拔除的健康第三磨牙或第一前磨牙， 牙齒拔出后立即用PBS溶液沖洗3 遍，再用無菌的銳利刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，并剪成1 mm3大小的組織塊。離心后，加入I型膠原酶2 mL， 并置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化。15 min后，用培養(yǎng)基終止消化并離心，將組織塊以1 mm間距平整放于6孔板中，上置蓋玻片，滴加含 100 mL/L FBS 的α-MEM培養(yǎng)液， 37 ℃、 50% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每隔3 d換液，待細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達(dá)80% 時(shí)，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，按1 ∶2或1 ∶3的比例傳代，實(shí)驗(yàn)選用4～6 代的細(xì)胞。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估PDLSCs的增殖能力

將處于對(duì)數(shù)生長期的PDLSCs細(xì)胞接種于96孔板上，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。 24 h后，對(duì)照組細(xì)胞加入100 μL不含姜黃素的培養(yǎng)基，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞則加入含40 μmol/L姜黃素的細(xì)胞培養(yǎng)基。分別于培養(yǎng)1、 2、 3、 4、 5、 6 d各時(shí)間點(diǎn)取出各組細(xì)胞，去除原有的培養(yǎng)基，再加入含10 μL CCK-8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 h。最后，用酶標(biāo)儀(Bio-Tek, Winooski, VT，美國) 測定每個(gè)測量孔在450 nm處吸光度，并記錄結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 ALP 活性的測定

取經(jīng)含或不含姜黃素的細(xì)胞培養(yǎng)及對(duì)PDLSCs細(xì)胞進(jìn)行1 周處理后，吸去培養(yǎng)液，PBS 沖洗后，按堿性磷酸酶測定試劑盒說明進(jìn)行操作，最后用酶聯(lián)儀檢測各孔520 nm波長處的吸光度值(A值)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

根據(jù)說明書，通過Trizol試劑進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)總RNA的提取，將500 ng的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板按照SYBR Green I法進(jìn)行目的基因的熒光定量PCR反應(yīng)。qPCR 反應(yīng)條件: 預(yù)變性，95 ℃、30 s，1 Cycle; PCR 反應(yīng)， 95 ℃、 5 s， 60 ℃、 20 s， 40 Cycles; 融解曲線分析， 95 ℃、 0 s， 65 ℃、15 s， 95 ℃、0 s。此外，本研究的引物序列如表 1所示。

1.6 茜素紅染色

收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的各組PDLSCs，多聚甲醛(4%)固定10 min， 茜素紅染色。將處理后的6 孔板置于倒置顯微鏡下觀察其礦化結(jié)節(jié)拍照，Image-Pro Plus 圖像處理軟件進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)定量分析。

表 1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)PDLCs增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的hPDLCs在加入40 μmol/L的姜黃素共培養(yǎng)后，所有時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力均較對(duì)照組細(xì)胞有所升高，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 1)。

2.2 姜黃素對(duì)PDLSCs成骨分化能力的影響

藥物誘導(dǎo)1 周后， 分別收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示加入姜黃素后，實(shí)驗(yàn)組中的成骨相關(guān)基因ALP、OCN以及Runx2的mRNA表達(dá)水平均明顯升高(圖 2)。此外，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)ALP活性明顯高于對(duì)照組(圖 3)。也就是說，姜黃素對(duì)PDLSCs成骨分化能力有促進(jìn)作用。

圖 1 姜黃素對(duì)PDLCs增殖能力的影響

圖 2 姜黃素對(duì)PDLSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖 3 姜黃素對(duì)PDLSCs的ALP活性的影響

2.3 姜黃素對(duì)Wnt信號(hào)相關(guān)信號(hào)通路的影響

RT-qPCR技術(shù)檢測姜黃素對(duì)PDLSCs細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典Wnt通路相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，姜黃素能顯著下調(diào)Wnt通路相關(guān)基因c-myc和β-catenin(圖 4)。此外，在經(jīng)姜黃素處理后的PDLSCs細(xì)胞株中加入氯化鋰后，PDLSCs成骨分化能力會(huì)有所下調(diào)(圖 4)。這一致說明了姜黃素引起的PDLSCs成骨分化能力增強(qiáng)是通過抑制細(xì)胞內(nèi)的Wnt通路起作用的。

2.4 姜黃素對(duì)PDLSCs鈣化結(jié)節(jié)形成的影響

茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比較，經(jīng)姜黃素處理可以明顯提高PDLSCs鈣化結(jié)節(jié)的形成量。當(dāng)在實(shí)驗(yàn)組中加入Wnt通路激動(dòng)劑(氯化鋰)，PDLSCs鈣化結(jié)節(jié)的形成量明顯減少(圖 5)。說明姜黃素可以通過調(diào)控Wnt通路發(fā)揮促PDLSCs成骨分化的作用。

圖 4 姜黃素對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖 5 姜黃素對(duì)PDLSCs礦化結(jié)節(jié)形成量的影響

3 討 論

牙周炎是由細(xì)菌引起的牙周組織慢性進(jìn)行性炎癥反應(yīng)，其最嚴(yán)重的并發(fā)癥是導(dǎo)致患者的牙齒喪失，而人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)是修復(fù)牙周缺損的關(guān)鍵細(xì)胞[9]。牙周膜干細(xì)胞是從牙周組織中分離培養(yǎng)而形成的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能[10-11]。但是，對(duì)于牙周炎患者而言，牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力會(huì)被顯著抑制。因此，探索能改善牙周炎患者牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的藥物并闡明其作用機(jī)制是近年來牙周組織修復(fù)與再生研究的熱點(diǎn)。

姜黃素是一種天然多酚，主要來源于中藥姜黃、莪術(shù)等植物，具有毒性小、價(jià)格便宜、易提取等優(yōu)勢(shì)。姜黃素藥理學(xué)作用廣泛，具有抗炎、抗纖維化及促成骨分化等多種生物學(xué)效應(yīng)。大量研究表明，姜黃素可以抑制破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨的重建，緩解各種不同原因所致的骨質(zhì)疏松[12-13]。同樣地，在本研究中，我們通過RT-qPCR技術(shù)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)姜黃素處理后，可以明顯上調(diào)PDLSCs的成骨分化相關(guān)基因(ALP、OCN以及Runx2)的表達(dá)水平，提高ALP的活性以及鈣化結(jié)節(jié)的形成量。但是，結(jié)果顯示姜黃素并不影響PDLSCs的增殖能力?？偟膩碚f，姜黃素能顯著改善PDLSCs細(xì)胞的成骨分化能力，但具體的作用機(jī)制尚不明確。

既往研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)細(xì)胞因子、生長因子信號(hào)通路的調(diào)控，包括BMP、Wnt、Notch、FGF、PI3K/Akt 等信號(hào)通路會(huì)影響成骨分化關(guān)鍵基因的表達(dá)與功能，在調(diào)控牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程起到重要的作用[14-15]。在牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中的研究較多為 Wnt 經(jīng)典信號(hào)通路，它在調(diào)控細(xì)胞的增殖、成骨分化中起著重要作用。廖海清等[16]發(fā)現(xiàn)阻斷經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路將會(huì)顯著減低ALP的活性，并顯著減少礦化結(jié)節(jié)的形成量，進(jìn)而抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能通過調(diào)控Wnt相關(guān)信號(hào)通路抑制多種腫瘤進(jìn)展，包括乳腺癌、肝癌等。因此，本研究提出假設(shè)：姜黃素有可能是通過阻斷Wnt信號(hào)通路來發(fā)揮促牙周膜干細(xì)胞成骨分化作用。本研究中，發(fā)現(xiàn)姜黃素的確能抑制Wnt信號(hào)通路關(guān)鍵基因c-myc和β-catenin的表達(dá)；同時(shí)，對(duì)經(jīng)姜黃素處理后的PDLSCs中加入Wnt通路激動(dòng)劑，PDLSCs的成骨分化能力會(huì)被明顯抑制。

本研究表明姜黃素能通過抑制Wnt相關(guān)信號(hào)通路的激活，促進(jìn) PDLSCs 向成骨細(xì)胞分化，這為其應(yīng)用于修復(fù)牙周骨缺損提供了科學(xué)依據(jù)。