朱福余，孫立魁，賈曉猛，劉成虎

硬組織病理切磨技術(shù)主要是針對(duì)骨組織、帶植入物的骨組織、埋置有堅(jiān)硬植入物的其他組織標(biāo)本，或在動(dòng)物試驗(yàn)階段進(jìn)行了親骨熒光素標(biāo)記的不能進(jìn)行脫鈣的骨組織，通過(guò)脫水、浸潤(rùn)、包埋處理，由硬組織切磨系統(tǒng)完成的組織病理切片制作的技術(shù)。有文獻(xiàn)報(bào)道骨組織及埋置堅(jiān)硬植入物的組織進(jìn)行病理組織切片制作，通常利用EXAKT硬組織切磨系統(tǒng)[1-3]。硬組織病理切磨技術(shù)最顯著的特點(diǎn)是不破壞組織中的植入物，且保持了組織與植入物之間原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，這對(duì)研究組織內(nèi)植入物的長(zhǎng)入情況具有重要意義。本文結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室日常硬組織制片工作經(jīng)驗(yàn)，分析硬組織病理切片制作的每個(gè)處理環(huán)節(jié)，以期能為其他技術(shù)人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本試驗(yàn)樣品CF/PEEK復(fù)合材料按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.6-2015醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)：植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)的要求進(jìn)行試驗(yàn)[4]。動(dòng)物試驗(yàn)周期結(jié)束后，獲取到埋置有CF/PEEK復(fù)合材料的肌肉組織塊合計(jì)36塊。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林(濟(jì)南百博生物公司)，無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)公司)，蘇木精染液、伊紅染液(北京索萊寶公司)，Technovit 7200 VLC樹(shù)脂試劑盒，EXAKT 300 CP硬組織切片機(jī)、400 CS硬組織磨片機(jī)、402平行粘片裝置、510脫水浸潤(rùn)儀、520光固化包埋機(jī)、530干燥滲透聚合裝置(德國(guó)EXAKT公司)。

1.3 方法

1.3.1組織標(biāo)本的固定 組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，固定液的量一般為被固定組織標(biāo)本體積的10倍。固定24 h后，更換新的10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林進(jìn)一步固定。

1.3.2組織的切割取材 將充分固定后的組織標(biāo)本經(jīng)硬組織切片機(jī)切割為5 mm厚標(biāo)本，置于10%磷酸鹽緩沖中性福爾馬林中繼續(xù)固定12 h后再進(jìn)行后續(xù)操作。切割取材前應(yīng)詳細(xì)觀察組織標(biāo)本塊的外觀，詳細(xì)了解植入物的植入位置、植入方向、植入深度等。切割取材過(guò)程中應(yīng)防止樣品與組織脫離。切割取材后的組織標(biāo)本置于自來(lái)水中，流水沖洗至少1 h，水流應(yīng)盡可能的小，操作過(guò)程應(yīng)輕柔，以防植入物與組織脫離。

1.3.3標(biāo)本脫水 將組織標(biāo)本依次置于50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ，分別脫水48 h，不同濃度乙醇要現(xiàn)用現(xiàn)配。在抽真空、震蕩的條件下進(jìn)行脫水會(huì)提高脫水效果。

1.3.4標(biāo)本浸潤(rùn) 脫水結(jié)束后，將標(biāo)本逐級(jí)浸入不同體積比的乙醇/Technovit 7200 VLC樹(shù)脂(70%/30%、50%/50%、30%/70%)混合液中進(jìn)行浸潤(rùn)，每一步驟處理48 h，后置于100%Technovit 7200 VLC樹(shù)脂Ⅰ缸處理14天，100%Technovit 7200 VLC樹(shù)脂Ⅱ缸處理14天。注意浸潤(rùn)過(guò)程中要避光，且溫度不超過(guò)25 ℃，每隔一段時(shí)間對(duì)樣本進(jìn)行監(jiān)控、檢查，避免其固化。值得注意的是，在抽負(fù)壓、真空條件下浸潤(rùn)，可以使組織得到充分浸潤(rùn)，且可以有效減少組織塊中殘存的氣泡。

1.3.5光固化包埋聚合 取出浸透完全的標(biāo)本，將需要觀察的組織切面向下置入塑料包埋模具中，加入Technovit 7200VLC光聚樹(shù)脂，利用EXAKT530干燥滲透聚合裝置抽真空，排凈組織塊內(nèi)殘存的氣泡。固化過(guò)程由低強(qiáng)度的黃光與高強(qiáng)度的藍(lán)光共同輻照完成，先黃光輻照6 h，后藍(lán)光輻照8 h，經(jīng)輻照光固化聚合后埋置有CF/PEEK復(fù)合材料的肌肉組織樹(shù)脂包埋塊(圖1)。

1.3.6平行粘片制作 利用千分尺測(cè)量載玻片A的厚度，共計(jì)測(cè)量3次，取平均值，將聚合過(guò)的組織標(biāo)本包埋塊從包埋模具中取出，利用Technovit 4000粘合劑套裝將包埋塊粘于載玻片A上。將粘附有標(biāo)本包埋塊的載玻片A經(jīng)真空吸附于EXAKT 300 CP切片機(jī)樣本頭上，通過(guò)激光定位裝置，在包埋標(biāo)本上進(jìn)行定位，經(jīng)帶鋸切割暴露出需要的切面，拋光后利用千分尺測(cè)量載玻片A、黏合劑、標(biāo)本包埋塊的總厚度，共計(jì)測(cè)量3次，取平均值。另取一張載玻片B，利用千分尺測(cè)量載玻片B的厚度，共計(jì)測(cè)量3次，取平均值。在EXAKT 402載片黏合裝置上用Technovit 7210 VLC精密粘合劑將載玻片B黏附于標(biāo)本塊的拋光面，如此載玻片A、樹(shù)脂包埋標(biāo)本塊、載玻片B合成一個(gè)類似三明治的結(jié)構(gòu)，測(cè)量其總厚度，共計(jì)測(cè)量3次，取平均值，進(jìn)而計(jì)算出膠的厚度，以便后續(xù)進(jìn)行切片。

1.3.7切片 用EXAKT 300 CP硬組織切片機(jī)將包埋有組織標(biāo)本的樹(shù)脂塊進(jìn)行切割，一般將切割厚度設(shè)為200 μm。值得注意的是，在切片過(guò)程中任何外力都會(huì)使切割面產(chǎn)生凹凸不平現(xiàn)象，因此切片過(guò)程中切勿施加外力干擾。切片完成后，取出切片，取下樣本塊，利用千分尺測(cè)量(切片+膠+組織)總厚度，進(jìn)而計(jì)算出實(shí)際切割下來(lái)的組織標(biāo)本厚度。

1.3.8磨片 經(jīng)EXAKT 400 CS硬組織磨片機(jī)進(jìn)行磨片，先進(jìn)行粗磨，再進(jìn)行精磨，最后進(jìn)行拋光，將組織磨至30 μm厚。

1.3.9組織切片的染色 將組織切磨片經(jīng)蒸餾水充分清洗后，參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行染色：蘇木精染液30 min，自來(lái)水充分沖洗，1%鹽酸乙醇分化30 s，流水沖洗后再入溫水返藍(lán)，置伊紅染液5 min，自來(lái)水沖洗，待組織切片自然干燥后經(jīng)Technovit 7210 VLC封片，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

制得的組織切片經(jīng)HE染色后，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)著色對(duì)比鮮明，組織細(xì)胞形態(tài)清晰，可直接在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察，可見(jiàn)植入的CF/PEEK復(fù)合材料與周邊肌肉組織結(jié)合緊密(圖2、3)，植入的復(fù)合材料周圍可見(jiàn)新生纖維結(jié)締組織，纖維囊壁結(jié)構(gòu)已形成。

①②③圖1 埋置有CF/PEEK復(fù)合材料的肌肉組織標(biāo)本樹(shù)脂塊圖2 低倍鏡下埋置有CF/PEEK復(fù)合材料的肌肉組織病理切片:a.試驗(yàn)樣品CF/PEEK復(fù)合材料;b.肌肉組織圖3 高倍鏡下埋置有CF/PEEK復(fù)合材料的肌肉組織病理切片:a.試驗(yàn)樣品CF/PEEK復(fù)合材料;b.肌肉組織

3 討論

GB/T16886.6-2015醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中提到對(duì)植入物的評(píng)價(jià)，要特別關(guān)注組織與材料之間的界面，且該標(biāo)準(zhǔn)推薦采用硬組織制片技術(shù)進(jìn)行組織切片制作[4]。對(duì)埋置有種植體的組織標(biāo)本進(jìn)行制片時(shí)，硬組織切磨技術(shù)可以直接切含有堅(jiān)硬植入物的組織標(biāo)本，而普通的石蠟包埋組織切片需要先剔除組織內(nèi)埋置的植入物，這往往會(huì)使原有的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，無(wú)法客觀的評(píng)價(jià)植入物與周邊組織的結(jié)合情況，影響后期的評(píng)價(jià)分析。骨組織是由大量鈣化的細(xì)胞間質(zhì)和骨組織細(xì)胞組成，為結(jié)締組織的一種，因細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)有大量鈣鹽沉積，故骨組織質(zhì)地十分堅(jiān)硬，石蠟包埋組織切片必須對(duì)骨組織進(jìn)行脫鈣處理[6-8]。脫鈣會(huì)使組織細(xì)胞皺縮，同時(shí)會(huì)使骨的礦化結(jié)構(gòu)遭到破壞，而硬組織切磨技術(shù)無(wú)需脫鈣處理，完整的保存了骨組織的礦化結(jié)構(gòu)，組織切片經(jīng)染色處理后，可用于研究骨修復(fù)材料植入后的骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)及骨整合相關(guān)的研究。雖然樹(shù)脂包埋硬組織制片也存在不足，如制片過(guò)程復(fù)雜，制片操作步驟繁瑣，盡管存在難點(diǎn)，但硬組織切磨技術(shù)能夠保持種植體與周邊組織界面的組織結(jié)構(gòu)，可直觀反應(yīng)結(jié)合界面的生長(zhǎng)結(jié)合情況，是目前研究種植體-組織結(jié)合界面重要的技術(shù)方法。