張 群，馬 晨，秦安麗，段 云，郇志博，吳 瓊

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 ?？?571101; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，海南 ?？?571101; 3.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，海南 ?？?571101)

0 引 言

豇豆，學(xué)名Vignaunguiculata(Linn.) Walp，又名豆角、長豆角等，是營養(yǎng)價值較高的一種蔬菜。豇豆在海南年栽培面積15萬畝～20萬畝，年總產(chǎn)量20萬噸～25萬噸，在北運蔬菜產(chǎn)業(yè)中具有重要地位和作用[1]。海南高溫高濕的環(huán)境利于病蟲害的發(fā)生，而豇豆為花果同期作物，其花期也是收獲期，蟲害爆發(fā)幾率更高：據(jù)調(diào)研發(fā)現(xiàn)主產(chǎn)區(qū)薊馬至少爆發(fā)3～4次，美洲斑潛蠅2～3次。菊酯類農(nóng)藥常用于防治豇豆蟲害，如甲氰菊酯對豇豆上二點螨有作用[2]，氯氟氰菊酯、氰戊菊酯和氯氰菊酯等可防治豇豆的豆莢螟[3]、蚜蟲[4]和美洲斑潛蠅[4-6]。這些農(nóng)藥中只有氯氰菊酯被登記用于豇豆防治豆莢螟[7]，且我國只對氯氟氰菊酯和氯氰菊酯在豇豆(或豆類)的最大殘留限量值規(guī)定，分別為0.2 mg/kg[8]和0.5 mg/kg[8]。為了規(guī)避潛在健康風(fēng)險，建立一種同時檢測豇豆中菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法是必要的。

目前菊酯類農(nóng)藥檢測方法包括氣相色譜法[9-11]、液相色譜法[12]、光譜分析法[13]、免疫分析法[14]和電化學(xué)傳感器技術(shù)[15]等，常用的還是氣相色譜法，本文采用一種農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù)-QuEchERS法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS)檢測建立了豇豆中6種菊酯農(nóng)藥含量的快速檢測方法，較于傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留檢測方法更簡單、快速、安全、價格低廉同時可提供高質(zhì)量農(nóng)藥殘留分析，為確保豇豆質(zhì)量安全提供有效的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientifi Trace 1310-TSQ 9000)；萃取試劑盒 (Agilent，適用歐盟 EN15662方法，鹽包：4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g 二水合檸檬酸三鈉、0.5 g 半水檸檬酸氫二鈉；2 mL QuEChERS 分散SPE試劑盒 (25 mg PSA、2.5 mg GCB、150 mg MgSO4)；2 mL QuEChERS 分散SPE試劑盒 (50 mg PSA、150 mg MgSO4)；2 mL QuEChERS 分散 SPE 試劑盒 (25 mg PSA、150 mg MgSO4)；毛細(xì)管氣相色譜柱 TG-5SILMS (30 m×0.25 mm，0.25 μm，Thermo公司)。

乙腈、丙酮、正己烷(HPLC級，美國Fisher)；其余試劑均為市售分析純。

豇豆，購于海南市場。甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%(天津農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

豇豆的取樣量參照CAC/GL 33—1999 《農(nóng)藥最大殘留限量符合性測定的推薦取樣方法》中植物源性初級食品（小尺寸新鮮產(chǎn)品）的取樣量進(jìn)行采樣，取豇豆鮮樣約1 000 g，用粉粹機(jī)粉碎，混勻，裝入潔凈的密封罐中，標(biāo)明編號，于-18 ℃保存。

參照進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4138—2015 《出口水果和蔬菜中敵敵畏、四氯硝基笨、丙線磷等88種農(nóng)藥殘留的篩選檢測QuEChERS-氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法》稱取10.0 g (精確至0.01 g)已制備好豇豆試樣于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，用多管渦旋混合器在2 500 r/min渦旋震蕩2 min，將試劑盒鹽包 (4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g 二水合檸檬酸三鈉、0.5 g 半水檸檬酸氫二鈉)加入萃取管中渦旋2 min，4 000 r/min離心5 min，上清液待凈化。

取1.8 mL上清液轉(zhuǎn)入預(yù)先加有凈化包的2 mL聚丙烯離心管中，用多管渦旋混合器在2 500 r/min渦旋震蕩2 min，再用高速離心機(jī)在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min。取上清液經(jīng)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，待GC-MS/MS檢測。菊酯類農(nóng)藥存在異構(gòu)體，依據(jù)GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》中食品中農(nóng)藥最大殘留限量： 中農(nóng)藥的殘留物定義進(jìn)行殘留檢測。

1.2.2 GC-MS/MS檢測條件

氣相條件：程序升溫，初始溫度 100 ℃，以25 ℃/min 升溫至 250 ℃，以 5 ℃/min 升溫至 280 ℃，保持 3 min；總運行時間：15 min；流量：1.0 mL/min；載氣：氦氣，純度≥99.999 %；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度：300 ℃；氣相質(zhì)譜接口溫度：280 ℃。選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)條件見表1。

表 1 SRM模式下待測農(nóng)藥的檢測條件

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：6種待測農(nóng)藥分別用正己烷配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于-18 ℃保存。

基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)品的配制：參照樣品前處理方法將空白的樣品(未有待測農(nóng)藥檢出的樣品)配制成基質(zhì)溶液，用基質(zhì)溶液對標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行稀釋制成所需的定量標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 準(zhǔn)確度與精密度測定

稱取3組不含6種農(nóng)藥的空白樣品，每組5個重復(fù)。在空白樣品中，分別添加6種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，添加濃度為 0.01，0.05，0.10 mg/kg，按照所建立的方法進(jìn)行檢測，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先對6種待測農(nóng)藥的單標(biāo)溶液(1.00 mg/L)進(jìn)行全掃描，得到待測農(nóng)藥的母離子和保留時間；其次分別對待測農(nóng)藥對應(yīng)的母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，得到待測農(nóng)藥的定量離子對和定性離子對；最后，分別優(yōu)化碰撞能量。優(yōu)化完畢后，建立待測農(nóng)藥的最優(yōu)選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 mg/L)典型譜圖如圖 1所示。

圖 1 SRM模式下總離子流圖

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取劑和凈化方法的選擇

新鮮豇豆嫩莢含葉綠素 160.0 mg/kg、含VC190.0 mg/kg、含有機(jī)酸2 g/kg、蛋白質(zhì)的含量為15 g/kg、可溶性固形物的含量為13.4g/kg[16]。同時考慮到擬除蟲菊酯類農(nóng)藥偏弱的極性及豇豆中葉綠素、蛋白質(zhì)含量高等因素，考察了常用農(nóng)殘?zhí)崛?乙腈、丙酮)及3種常用QuEChERS 分散 SPE試劑 (X.25 mg PSA、2.5 mg GCB、150 mg MgSO4；Y.50 mg PSA、150 mg MgSO4；Z.25 mg PSA、150 mg MgSO4)的提取效果。提取劑和分散SPE試劑對6種農(nóng)藥的提取效果見圖2，結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度為0.05 mg/kg時，乙腈提取，X凈化，6種農(nóng)藥的樣品回收率符合《農(nóng)藥登記殘留試驗準(zhǔn)則》中檢測方法開發(fā)要求(當(dāng)添加濃度在0.01～0.1mg/kg之間時，平均回收率70%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜20%)，故選擇乙腈提取，QuEChERS 分散SPE試劑(X.25 mg PSA、2.5 mg GCB、150 mg MgSO4)凈化。

圖 2 提取劑對6種菊酯農(nóng)藥的提取效果

2.3 線性方程、定量限、回收率和精密度

2.3.1 線性方程、檢出限及定量限

按1.2.3所述配制的0.001～0.500 mg/L內(nèi)6個濃度梯度 (0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.01 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.500 mg/L)的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣。在1.2.2的檢測條件下，以進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性方程(表2)。結(jié)果表明，在0.001～0.500 mg/L范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99。

表 2 6種菊酯農(nóng)藥的線性方程及決定系數(shù)

依照3倍信噪比(S/N)對豇豆中6種菊酯農(nóng)藥的檢出限 (LOD)進(jìn)行計算，得到 LOD為 9×10-5mg/kg；再依據(jù)10倍信噪比確定其定量限(LOQ)為3×10-4mg/kg。通過實際添加回收試驗，最終確定豇豆中甲氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的定量限為0.003 mg/kg，氯氟氰菊酯、氯氰菊酯和氟胺氰菊酯的定量限為0.001 5 mg/kg，5次試驗的平均回收率為75.3%～87.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍5.7%～13.2%。本方法的定量限可以滿足我國、歐盟和日本豇豆中6種菊酯農(nóng)藥的最大殘留限量(MRL)檢測要求。

2.3.2 精密度和回收率

依據(jù)豇豆中6種菊酯農(nóng)藥的MRL值以及方法的靈敏度，對豇豆樣品設(shè)定了0.01 mg/kg、0.05 mg/kg和0.1 mg/kg 3個濃度的添加水平，其平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3。在3個添加濃度水平下，6種菊酯農(nóng)藥殘留的平均回收率在89.6%～106.9%之間；5次重復(fù)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.0%～11.9%，均能夠滿足定量檢測要求。

表 3 6種農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝5)

3 實際樣品分析

利用該方法測定了海南省2018年11月-2019年5月共計52份樣品：共檢出氯氰菊酯10例，檢出率19.2%，檢出濃度0.011～0.47 mg/kg；依據(jù)我國現(xiàn)有GB 2763—2019標(biāo)準(zhǔn)豇豆上氯氰菊酯的 MRL為0.5 mg/kg，判定豇豆樣品中氯氰菊酯的超標(biāo)率為0%，最高濃度為0.47 mg/kg。共檢出氯氟氰菊酯7例，檢出率為13.5%，檢出濃度0.008～0.12 mg/kg；依據(jù)我國現(xiàn)有GB 2763—2019標(biāo)準(zhǔn)豇豆上氯氟氰菊酯的 MRL為0.2 mg/kg，判定豇豆樣品中氯氟氰菊酯的超標(biāo)率為0，最高濃度為0.12 mg/kg。共檢出甲氰菊酯3例，檢出率為5.7%，檢出濃度0.039～0.102 mg/kg；鑒于我國目前尚未制定甲氰菊酯在豇豆中的MRL標(biāo)準(zhǔn)，無法判斷；參考較為嚴(yán)格的歐盟MRL標(biāo)準(zhǔn)（0.01 mg/kg），則豇豆樣品中甲氰菊酯殘留超標(biāo)率為100%。其他3種菊酯農(nóng)藥(氟氯氰菊酯、氟胺氰菊酯、氰戊菊酯)未有檢出。

4 結(jié)束語

本研究建立了QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豇豆中6種菊酯農(nóng)藥殘留的檢測方法。本方法從色譜工作條件、提取劑和凈化劑3個方面對實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，使得樣品前處理簡便快速且回收率高，能夠較好地排除基質(zhì)干擾；檢出限及精密度均能滿足歐盟等國豇豆中6種菊酯類農(nóng)藥最大殘留限量的檢測要求，為監(jiān)管監(jiān)測提供技術(shù)支撐，保障人體健康，回避潛在食用風(fēng)險。在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)查詢菊酯類農(nóng)藥在豇豆上的登記情況，結(jié)果顯示氯氰菊酯和氯氟氰菊酯有登記用于防治豇豆豆莢螟，我國制定的限量標(biāo)準(zhǔn)與之一致，檢出未超標(biāo)。而甲氰菊酯在豇豆上尚未登記，雖有檢出，鑒于我國目前尚未制定甲氰菊酯在豇豆中的MRL標(biāo)準(zhǔn)，未能下結(jié)論；當(dāng)參考較為嚴(yán)格的歐盟標(biāo)準(zhǔn)時，則超標(biāo)100%，故建議相關(guān)部門加強農(nóng)藥使用監(jiān)管。