張 茹，杜 娟

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

五指毛桃為?？?Moraceae)榕屬(Ficus)植物粗葉榕(FicushirtaVahl)的干燥根[1]，主要分布于我國南部及西南部地區(qū)，其根、果均可入藥.傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，五指毛桃具有健脾補(bǔ)氣、化濕行氣、舒筋活絡(luò)等功效.近年來研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃中含有苯丙素類、黃酮類、萜類、甾醇類及揮發(fā)油類等多種類型的化合物[2].有研究表明，五指毛桃對(duì)毒品可卡因所致的肝毒性、二甲基甲酰胺所致的急性肝損傷及拘束應(yīng)激性肝損傷等均具有優(yōu)良的肝保護(hù)作用[3-5].有關(guān)五指毛桃對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究還相對(duì)較少，本文旨在通過復(fù)制小鼠醉酒模型，以五指毛桃提取液為實(shí)驗(yàn)藥物，以葛花為陽性對(duì)照，考察五指毛桃對(duì)酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)中小鼠的干預(yù)保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR雄性小鼠，體重18～22 g，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：STK(吉2018-0007).

1.2 材料與試劑

五指毛桃購自廣東省河源市、葛花購自黑龍江省哈爾濱市中藥市場(chǎng)，經(jīng)中藥教研室張翠教授鑒定為正品.56度牛欄山二鍋頭，北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠.超氧化物歧化酶(SOD)、還原谷胱甘肽(GSH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.

1.3 儀器與設(shè)備

XZC-1型小鼠自主活動(dòng)測(cè)定儀、722型紫外-可見光分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、多功能酶標(biāo)儀(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥物的制備

1)葛花提取液的制備

稱取葛花，料液比1∶10，水中浸泡1 h后煎煮.煮沸后改文火煮1 h，傾出煎液加10倍量水繼續(xù)煎煮1 h.合并兩次濾液，將濾液濃縮為2 g/mL濃縮液，密封，放入冰箱4 ℃冷藏備用.

2)五指毛桃提取液的制備

稱取五指毛桃，加入10倍量水，水中浸泡1 h后煎煮.煮沸后改文火煮1 h ，傾出煎液加10倍量水繼續(xù)煎煮1 h.合并兩次濾液，將濾液濃縮為2 g/mL 濃縮液，密封，放入冰箱 4 ℃冷藏備用.

1.4.2 分組及給藥

將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、葛花組、五指毛桃低、中、高劑量組.葛花組按0.53 g/(kg·d)劑量灌胃葛花提取液；五指毛桃低、中、高劑量組按0.2 g/(kg·d)、0.4 g/(kg·d)、0.6 g/(kg·d)劑量灌胃五指毛桃提取液；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量0.9 %生理鹽水.30 min后，除空白對(duì)照組外，劑量組和模型對(duì)照組分別按劑量10 mL/kg 灌胃牛欄山二鍋頭(56%乙醇)，連續(xù)灌胃10天，空白對(duì)照組灌胃等量蒸餾水.給藥劑量參考文獻(xiàn)[6-8]和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定.各組均常規(guī)飲水和喂食.每日灌胃前稱量記錄小鼠體質(zhì)量.末次給藥2 h后進(jìn)行標(biāo)本采集.

1.4.3 自主活動(dòng)試驗(yàn)

將灌酒后的小鼠放入自主活動(dòng)儀內(nèi)，適應(yīng)5 min.然后開始記錄小鼠在自主活動(dòng)箱5 min內(nèi)穿越格子的數(shù)量，作為小鼠自主活動(dòng)次數(shù).

1.4.4 肝臟標(biāo)本采集及檢測(cè)

處死小鼠，剖腹取小鼠肝臟組織，放入預(yù)冷的生理性鹽水中快速漂洗去除血跡，濾紙吸干肝組織的生理鹽水，擦拭后稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=完整肝臟濕重/體質(zhì)量×100%.按照組織質(zhì)量:生理鹽水體積比為1∶9的比例加入生理鹽水，手動(dòng)研磨制成10%肝組織勻漿.分別測(cè)定肝勻漿組織中GSH含量及SOD活性.采用ELISA法檢測(cè)肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α和 NF-κB水平.采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì).

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化

與造模前相比，各組小鼠體質(zhì)量并無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表1.

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化

2.2 各組小鼠自主活動(dòng)變化

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組的自主活動(dòng)次數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃各劑量組小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)有所減少，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃高劑量組小鼠自主活動(dòng)次數(shù)減少，但差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)果見表2.

表2 各組小鼠自主活動(dòng)變化

2.3 各組小鼠肝臟指數(shù)變化

與空白對(duì)照組相比，模型組的肝臟指數(shù)升高(P<0.05)，說明造模成功，五指毛桃低、中劑量組肝臟指數(shù)與空白對(duì)照組相接近，兩者差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型對(duì)照組相比，各組動(dòng)物肝臟指數(shù)均有所下降，其中，五指毛桃低劑量組的肝臟指數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)；與葛花組相比，五指毛桃低、中劑量組的肝臟指數(shù)低于葛花組，兩者差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)果見表3.

表3 各組小鼠肝臟指數(shù)變化

2.4 各組小鼠肝組織中GSH含量及SOD活性變化

2.4.1 各組小鼠肝組織中GSH含量變化

與空白對(duì)照組相比，模型組GSH含量顯著降低(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃各劑量組GSH含量雖有所升高，但沒有顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃各劑量組GSH含量有所降低，但沒有顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表4.

2.4.2 各組小鼠肝組織中SOD活性變化

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組SOD活性顯著降低(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃中、高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.05)，五指毛桃低劑量組SOD活性雖有所升高，但沒有顯著性差異(P>0.05).與葛花組相比，五指毛桃中、高劑量組SOD活性顯著升高(P<0.05).SOD活性隨五指毛桃劑量的增加而升高.結(jié)果見表4.

表4 各組小鼠肝組織中GSH含量及SOD活性變化

2.5 各組小鼠肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α及NF-κB水平變化

2.5.1 各組小鼠肝組織中IL-6水平變化

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組IL-6水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃中劑量組IL-6水平顯著降低(P<0.05)，五指毛桃高、低劑量組IL-6水平雖有所降低但無顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃各劑量組IL-6水平有所升高，但無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表5.

2.5.2 各組小鼠肝組織中IL-1β水平變化

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃高、中劑量組IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，五指毛桃低劑量組IL-1β水平雖有所降低但無顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃高劑量組IL-1β水平有所降低但無顯著性差異(P>0.05).IL-1β水平隨五指毛桃劑量的增加而降低.結(jié)果見表5.

2.5.3 各組小鼠肝組織中TNF-α水平變化

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃高、中劑量組TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，五指毛桃低劑量組TNF-α水平雖有所降低但無顯著性差異(P>0.05)；與葛花組相比，五指毛桃高、中劑量組TNF-α水平有所升高但無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表5.

2.5.4 各組小鼠肝組織中NF-κB水平變化

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組NF-κB水平顯著升高(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組相比，五指毛桃高劑量組NF-κB水平顯著降低(P<0.05).與葛花組相比，五指毛桃組NF-κB水平有所升高但無顯著性差異(P>0.05).結(jié)果見表5.

表5 各組小鼠肝組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平變化

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中對(duì)飲酒傷肝的認(rèn)識(shí)和論述已有悠久的歷史，如文獻(xiàn)記載為“脅痛”“酒疸”“傷酒”“酒癖”“酒臌”等證候名[9].中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，酒為水谷之精，乃大熱之品.《本草綱目》記載: “酒…苦、甘、辛、大熱、有毒；行藥勢(shì)，通血脈，潤皮膚，散濕氣，除風(fēng)下氣；少飲則和血行氣，多飲則殺人頃刻”[10].過量飲酒可導(dǎo)致臟腑功能失調(diào)，出現(xiàn)肝臟的損傷，其基本病因、病機(jī)為脾虛血瘀[11]，酒乃濕熱之邪，酒熱藏匿于血分，氣血津液被擾，從而出現(xiàn)氣滯、血瘀、痰凝等病理因素的蘊(yùn)積；濕氣屬陰，易傷脾氣，脾的運(yùn)化功能失常，使氣血生化不足，出現(xiàn)脾腎虧虛；熱邪屬陽，傷及肝陰，肝虛及腎，從而出現(xiàn)肝脾腎三臟及氣血陰陽的虛損[12-13].現(xiàn)代研究表明，酒精在肝臟氧化，其代謝過程會(huì)利用氧化應(yīng)激誘發(fā)大量自由基生成，從而引起機(jī)體功能紊亂，造成多系統(tǒng)損傷.正常肝組織內(nèi)存在多種抗氧化物質(zhì)，其中GSH、SOD的水平是反映酒精性肝損傷時(shí)肝臟清除自由基能力和抗氧化能力的重要指標(biāo)，在抵抗酒精所致的肝損傷中起到關(guān)鍵作用[14]，提高SOD和GSH的活性，清除肝細(xì)胞中的自由基可以有效減輕酒精對(duì)機(jī)體的損傷.酒精引起的氧化損傷還可以繼發(fā)性激活肝臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)[15].NF-κB是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激和促炎性細(xì)胞因子能夠快速短暫激活NF-κB[16]，TNF-α、IL-6和IL-1β是NF-κB的經(jīng)典激活途徑中的靶點(diǎn)，與NF-κB結(jié)合使其被激活，介導(dǎo)肝組織變性、壞死，從而出現(xiàn)酒精性肝病[17-19].

現(xiàn)代研究提示，五指毛桃對(duì)化學(xué)性肝損傷，如急性CCl4肝損傷、二甲基甲酰胺所致肝損傷等具有保護(hù)作用[5,20].而葛花可有效減少由乙醇引起的肝細(xì)胞損傷[21-22].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，五指毛桃提取物可明顯升高GSH含量及SOD活力，說明五指毛桃具有一定的抗氧化能力，可以通過增加GSH含量、提高SOD活性來減輕酒精對(duì)機(jī)體的損傷，對(duì)于酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用.此外，五指毛桃提取物可使肝組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α、NF-κB水平下降，這可能與其主要活性成分香豆素類化合物、黃酮類化合物有關(guān).五指毛桃富含較多類黃酮類成分，黃酮類化合物具有豐富的藥理活性如抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒及抗凝血等[23-24]；香豆素類化合物在五指毛桃中廣泛存在，是其主要活性成分，也是最早從中分離到的一類活性成分，其中補(bǔ)骨脂素及佛手柑內(nèi)酯已成為五指毛桃指標(biāo)成分群中最有價(jià)值的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[2].因此，可以從五指毛桃保護(hù)肝損傷的有效成分及其作用機(jī)理進(jìn)一步深入研究，為五指毛桃的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ).