劉 暢，聶承冬，鄧 斌，李文娣，劉博男，侯冰喬，王淇漩，李文蘭*，溫 靜*

(1. 哈爾濱商業(yè)大學 藥學院，哈爾濱 150076；2. 哈爾濱商業(yè)大學 藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076)

卷柏為卷柏科卷柏屬植物Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring，主要功效為活血通經(jīng)[1].卷柏在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次記載為為活血化瘀類藥物[2].研究發(fā)現(xiàn)卷柏具有抗凝血或抑制血小板聚集的作用.在中醫(yī)范疇中，血栓即為血瘀證[3].卷柏被用作促進血液循環(huán)的傳統(tǒng)中藥，具有較好的抗血栓活性，在中藥臨床上常用于治療血栓相關(guān)疾病，例如腦血、心肌缺血及糖尿病并發(fā)癥等[4].目前卷柏活血通經(jīng)的功效作用機制尚不明確，基于此，本文通過網(wǎng)絡藥理學的方法，分析卷柏活血通經(jīng)的作用機制，為卷柏的現(xiàn)代藥理學提供參考.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫有PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、String (https://string-db.org/cgi/input.pl)、TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Cancer HSP(http://tcmspw.com/CancerHSP.php)、OMIM(http://www.omim.org/)、Uniprot(https://www.uniprot.org)、swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和DAVID6.7 ( https://david. ncifcrf. gov/)；Cytoscape 3.7.2.

1.2 卷柏活性成分的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選活性成分，條件為“OB>30%和DL ≥0.18”.同時通過文獻檢索，收集補充卷柏活性成分進，最終確定卷柏的主要活性成分.

1.3 卷柏活性成分活血通經(jīng)靶點的篩選

利用TCMSP，CancerHSP和PubChem數(shù)據(jù)庫獲取卷柏中活性成分的作用靶點.4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，F(xiàn)arrerol，F(xiàn)astigilinB這些成分通過SwissTargetPrediction進行預測，再通過Uniprot進行基因信息校正，獲得預測的卷柏成分靶點.卷柏在活血方面研究主要用痛經(jīng)，經(jīng)閉，抗血栓，抗凝血故以“Dysmenorrhea，Amenorrhea，Anti-thrombotic，Anticoagulant”為關(guān)鍵詞，在GAD和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索整理基因，從而確定卷柏痛經(jīng)、經(jīng)閉、抗血栓、抗凝血的作用靶點.

1.4 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

將卷柏的活血通經(jīng)作用靶點和活性成分導入Cytoscape中，并構(gòu)建網(wǎng)絡圖，篩選出核心網(wǎng)絡，從而得到卷柏活血通經(jīng)的主要活性成分.

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將卷柏痛經(jīng)、經(jīng)閉、抗血栓、抗凝血的靶點基因?qū)雜tring平臺中，獲取數(shù)據(jù)，構(gòu)建卷柏活血通經(jīng)相關(guān)疾病的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI).

1.6 核心靶點富集分析與可視化

通過DAVID6.7，對卷柏的靶點進行GO與KEGG富集分析.

2 實驗結(jié)果

2.1 卷柏活性成分的篩選

以OB>30%和DL ≥0.18為指標，共得到26個卷柏的活性化合物，見表1～3.

表1 卷柏中的活性成分(TCMSP)

表2 通過Swiss Target Prediction預測生物利用度獲得的活性成分

表3 通過文獻補充的卷柏活性成分

2.2 收集卷柏活性成分作用靶點

通過TCMSP，Pubmed 數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction預測確認了卷柏各個活性成分抗凝血、抗血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉相關(guān)靶點，依據(jù)數(shù)據(jù)庫挖掘得到凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉相關(guān)基因，去重后得到1243個，將凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉靶點與藥物靶點映射，得到靶點342個，確定為卷柏抗凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉的靶點基因.

2.3 活性成分-作用靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

卷柏活血通經(jīng)靶點基于以343個凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉靶點基因，建立卷柏化合物-活血通經(jīng)靶點網(wǎng)絡圖(如圖1所示)，通過網(wǎng)絡拓撲學結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)得到中位度數(shù)為10，在度值> 10的化合物中，有4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，F(xiàn)arrerol，F(xiàn)astigilinB，度值分別為28、28、27、26、26、26、25、25、22、19、14、13這些可能是卷柏中主要抗凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉的物質(zhì)基礎.

圖1 卷柏成分-靶點相互作用網(wǎng)絡

2.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

卷柏活血通經(jīng)蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)中節(jié)點平均度數(shù)是8，以大于2倍Degree數(shù)值即16，篩選出核心靶點，得到9個核心靶點，具體見表4，它們與其他蛋白相互作用更強些，在該網(wǎng)絡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用.

表4 核心靶點及拓撲參數(shù)

2.5 核心靶點富集分析與可視化

采用DAVID數(shù)據(jù)庫對卷柏活性成分抗凝血、血栓、痛經(jīng)、經(jīng)閉靶點進行GO和KEGG分析.GO分析結(jié)果中，細胞生物過程富集的基因數(shù)較多，說明卷柏主要通過調(diào)節(jié)以上生物過程發(fā)揮活血通經(jīng)作用.根據(jù)Count排序，篩選出BP Bioprogress13個，CC cell components11個，MF Molicular Function10個，結(jié)果如圖2(根據(jù)Count排序，取前十)所示，Pathway10個，結(jié)果如表3所示.KEGG分析中有10條信號通路，如Proteoglycans in cancer、Estrogen signaling pathway、Bladder cancer等，對10條通路進行可視化處理，結(jié)果如圖3所示.

圖2 卷柏活血通經(jīng)靶點生物過程(GO)富集分析結(jié)果

表5 卷柏活血通經(jīng)靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果

圖3 卷柏主要靶點富集通路氣泡圖

表4 KEGG通路富集分析

3 討 論

血栓性疾病是由血栓過度形成導致血管部分或完全堵塞引起的相關(guān)疾病.血栓分布在人體不同部位引起的腦血管、心血管及外周性血管疾病的患病率及死亡率處于上升趨勢，因此治療血栓疾病的關(guān)鍵是要預防血栓的形成[4-10].在中醫(yī)理論中，痛經(jīng)的主要原因是六大外感邪入侵造成的肝氣郁結(jié)，氣滯兼阻滯血流，進一步形成血瘀和腫塊，經(jīng)期疼痛是由于血液停滯和滯留[11-16].活血化瘀藥主治血瘀證和血栓相關(guān)疾病等，而卷柏在中國被廣泛用作改善血液循環(huán)的藥物[17].同時《神農(nóng)本草經(jīng)》又將卷柏列為活血化瘀藥.研究發(fā)現(xiàn)，卷柏可以延長小鼠的凝血時間，具有抗凝血作用[18].但卷柏活血通經(jīng)的藥效物質(zhì)基礎較薄弱，本文基于網(wǎng)絡藥理學分析預測卷柏中活血通經(jīng)分子作用機制.

在卷柏活性成分及疾病靶點網(wǎng)絡中分析表明AKT1、ALB、VEGFA、EGFR、PTGS2、MMP9、KDR、ESR1和MMP2等可能是卷柏的主要靶點，其中AKT1在靶點網(wǎng)絡PPI中度值相對較大，AKT1是促炎因子，在高血壓導致的心肌纖維化中，可能通過促進炎癥反應，進而調(diào)節(jié)成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化為發(fā)揮作用[19].通路富集分析結(jié)果表明卷柏活血通經(jīng)靶點主要集中在Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、Estrogen signaling pathway、Bladder cancer、VEGFsignaling pathway等通路.抗凝和促凝是兩個重要的生理過程，促凝和抗凝過程之間的平衡發(fā)生紊亂，最終可能導致嚴重出血或血栓形成，許多源自中藥的天然產(chǎn)物在治療出血或血栓形成方面顯示出其治療潛力，中藥卷柏具有良好的抗凝血作用，可消除血瘀，如心肌缺血和糖尿病并發(fā)癥，同時有文獻報道卷柏中的穗花杉雙黃酮能通過抑制血小板聚集起到活血的作用[4,20]，但卷柏炭則具有止血的作用[18]，盡管有報道稱卷柏炒后某些黃酮類化合物減少，但沒有研究揭示具體的化合物，現(xiàn)代綜合性藥理實驗很少進行[20].

綜上，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法預測及分析卷柏活血通經(jīng)活性成分的可能作用靶點及通路，確認4-Hydroxy Mephenytion，8-Demethyl Farrerol，selaginellin A，Amentoflavone，Apigenin，Azaleatin，Caffeic Acid，selaginellin D，Demethylfuropinnarin，Dihydroresveratrol，F(xiàn)arrerol，F(xiàn)astigilinB可能是卷柏活血通經(jīng)的主要活性成分，但其作用機制還有待于進一步研究.