畢英杰，謝晶瑩，許淑娟，鄧盈盈，李倬，馮若飛

1.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州730070

腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）于1945 年由HELWIG 和SCHMIDT 于佛羅里達州邁阿密首次分離［1］，1958 年，巴拿馬報道 EMCV 可感染豬并引起致死性心肌炎［2］。我國于2005 年首次分離獲得EMCV，命名為BJC3［3］。該病毒屬小RNA 病毒科，心病毒屬，是無囊膜單股正鏈RNA 病毒，病毒衣殼為直徑30 nm 的二十面體對稱結構，每個衣殼由 VP1、VP2、VP3 和 VP4 4 種結構蛋白組成［4］。該病毒可致仔豬致死性心肌炎及懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎與木乃伊胎，給各國養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失［5］。

干擾素誘導跨膜蛋白2（interferon induced transmembrane proteins 2，IFITM2）是干擾素誘導跨膜蛋白家族成員之一，1984 年，F(xiàn)RIEDMAN 等［6］通過 cDNA文庫篩選，在經(jīng)干擾素治療的神經(jīng)母細胞瘤中鑒定出IFITM 基因。目前，已在人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 和 IFITM10，其基因位于 11 號染色體上［7］，其中IFITM2 主要位于細胞內(nèi)相關區(qū)室，但具體位置尚未明確［8］。有研究證明，IFITM 是一種內(nèi)源性限制因子，可抑制甲型流感病毒和登革熱病毒［9］，其抗病毒作用廣泛，包括西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）、埃博拉病毒（ebola virus，EBOV）、馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）、人類免疫缺陷病毒1 型（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）、黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）、水泡性口炎病毒（vesicular stoma-titis virus，VSV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等［10-15］。本研究通過構建重組表達質粒pcDNA3.1-IFITM2，在 HEK293 細胞中探討 IFITM2 對 EMCV 感染的影響，為后續(xù)其作用機制的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株、病毒、質粒及基因序列 HEK293細胞、BHK-21 細胞、感受態(tài) E.coli BL21、EMCV 毒株PV21 及空載體pcDNA3.1 均由西北民族大學生物醫(yī)學研究中心提供；靶向IFITM2 的siRNA 序列（siRNA001 序列為：5′-ACCACATTGTGCAAACCTT-3′，siRNA002 序列為：5′-CCAACTACGAGATGCTCAA-3′，siRNA003 序列為：5′-CCATTCTGCTCATCATCAT-3′）及對照序列siRNANC 均由廣州瑞博生物科技公司設計合成。

1.2 主要試劑 胰蛋白酶、DMEM 基礎培養(yǎng)基及新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；重組人干擾素 α-2a（recombinant human interferon alpha-2a，IFNα-2a）購自沈陽三生制藥集團；細胞總RNA 提取試劑盒 RNAiso plus、LA-Taq 聚合酶及 M-MLV 反轉錄酶購自日本TaKaRa 公司；去內(nèi)毒素質粒提取試劑盒購自美國Omega 公司；SYBR Select Master Mix購自美國AppliedBiosystems 公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent 購自美國 Invitrogen 公司；Opti-MEM 購自美國Gibco 公司；鼠抗β-actin 單克隆抗體購自美國Abcam 公司；兔抗IFITM2 多克隆抗體購自美國Proteintech 公司；HRP 標記的山羊抗鼠及山羊抗兔IgG 購自美國Jackson 公司；Trans-Blot Turbo Mini-size Transfer Stacks 及 Hyper Singal 高敏 ECL 化學發(fā)光底物試劑盒購自美國BIO-RAD 公司；RIPA細胞裂解液及PMSF 蛋白保護劑均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 將液氮保存的HEK293 及BHK-21細胞于37 ～40 ℃溫水中快速溶解，300× g 離心10 min；棄上清，加入1 mL 含10% NBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸，轉移至細胞瓶，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 重組表達質粒的構建 根據(jù)GenBank 中登錄的人源IFITM2 基因序列（NM_006435），應用 Primer 5.0 軟件設計基因引物，F(xiàn)：5′-GGGGATCCATGAACCACATTGTGCAAAC-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位 點），R：5′-GGGAATTCCTATCGCTGGGCCTGGACGA-3′（下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），擴增產(chǎn)物大小為439 bp。引物由西安擎科澤西生物技術有限公司合成。參考文獻［16］方法構建人源IFITM2 重組表達質粒，經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質粒送西安擎科澤西生物技術有限公司測序，測序正確的重組表達質粒命名為pcDNA3.1-IFITM2。

1.5 HEK293 細胞中IFITM2 過表達情況的檢測在LipofectamineTM2000 的介導下，將重組表達質粒pcDNA3.1-IFITM2 及空載體 pcDNA3.1 轉染至HEK293 細胞中，于37 ℃轉染 24 h 后，收集 HEK293細胞，按RNAiso plus 試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以其為模板進行qPCR 擴增，擴增條件為：95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火34 s，共40 個循環(huán)。轉染48 h 后，收集轉染細胞，RIPA 裂解，經(jīng)15% SDS-PAGE 分離蛋白后，轉移至PVDF 膜，用2.5% 脫脂奶粉于室溫封閉1 h；TBST洗滌 3 次，加入兔抗 IFITM2 多克隆抗體（1 ∶3 000稀釋）及鼠抗 β-actin 單克隆抗體（1 ∶5 000 稀釋），于 4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次，加入 HRP 標記的山羊抗兔及山羊抗鼠IgG（1 ∶10 000 稀釋），室溫孵育1 h；ECL 法顯色。同時設空白對照組（未轉染）。

1.6 IFITM2 過表達對EMCV 增殖影響的檢測 在LipofectamineTM2000 的介導下，將重組表達質粒pc-DNA3.1-IFITM2 和空載體pcDNA3.1 轉染至HEK293細胞，于 37 ℃培養(yǎng) 24 h；按 100 TCID50的 EMCV 感染 HEK293 細胞，37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育 2 h；棄培養(yǎng)液，加入含3% NBS 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h；-80 ℃反復凍融 3 次；于 4 ℃，5 000 × g離心10 min，取培養(yǎng)上清，參照文獻［17］方法檢測病毒拷貝數(shù)，TCID50法檢測病毒滴度。

1.7 HEK293 細胞中IFITM2抑制效果的檢測 在LipofectamineTM2000 的介導下，將 siRNA（siRNA001、siRNA002、siRNA003）及 siRNANC 序列轉染至 HEK-293 細胞（預先經(jīng) 2 000 IU ／ mL IFNα2a 刺激 12 h），于37 ℃培養(yǎng)24 h。采用qPCR 法及Western blot 法檢測干擾效果，方法同1.5 項。

1.8 IFITM2 下調(diào)對EMCV 體外增殖影響的檢測將抑制IFITM2表達的HEK293 細胞進行EMCV 感染，并檢測子代病毒的病毒拷貝數(shù)和病毒滴度，方法同 1.6 項。

1.9 IFITM2 過表達對EMCV 吸附影響的檢測HEK293 細胞長滿至單層，在LipofectamineTM2000 的介導下，轉染重組表達質粒pcDNA3.1-IFITM2，轉染24 h 后，按 MOI = 3 接種 EMCV，4 ℃孵育 2 h；用預冷的1 × PBS 洗去未結合的病毒粒子，收集細胞，提取總RNA，參照文獻［17］方法檢測病毒拷貝數(shù)，即為吸附的病毒粒子數(shù)。

1.10 IFITM2 過表達對EMCV 進入影響的檢測HEK293 細胞長滿至單層，在LipofectamineTM2000 的介導下，轉染重組表達質粒pcDNA3.1-IFITM2，轉染24 h 后，按 MOI = 3 接種 EMCV，4 ℃孵育 2 h；用預冷的1 × PBS 洗去未結合的病毒粒子，加入3% NBS DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃孵育 2 h；棄培養(yǎng)上清，1 × PBS洗滌細胞，收集細胞，提取RNA，參照文獻［17］方法檢測病毒拷貝數(shù)，即為進入的病毒粒子數(shù)。

1.11 統(tǒng)計學分析 應用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均采用均值 ± 標準差（±s）表示，組間比較采用T-tests 及One-way ANOVA 方法，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 目的基因擴增產(chǎn)物的鑒定 IFITM2 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見439 bp 的目的基因片段，大小與預期一致，見圖1。

2.2 重組表達質粒的鑒定 重組表達質粒pcDNA3.1-IFITM2 的雙酶切（BamHⅠ／ EcoRⅠ）產(chǎn)物經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見約439 和5 428 bp 的目的基因片段及載體片段，大小與預期一致，見圖2。測序結果顯示，擴增片段與NCBI原始序列同源性為100%。表明重組質粒pcDNA3.1-IFITM2 構建正確。

圖1 IFITM2 基因PCR 產(chǎn)物的電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of IFITM2 gene

圖2 重組質粒pcDNA3.1-IFITM2 的雙酶切（BamHⅠ／EcoRⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pcDNA3.1-IFITM2（BamHⅠ／ EcoRⅠ）

2.3 HEK293 細胞中IFITM2 的過表達 pcDNA3.1-IFITM2 組、pcDNA3.1 組和空白對照組 HEK293 細胞IFITM2 基因mRNA 轉錄水平分別為 1 478.220 00、1.057 50、1.004 24，蛋白表達水平分別為1.80、1.14、1.00。 pcDNA3.1-IFITM2 組 HEK293 細胞IFITM2 基因mRNA 轉錄水平及蛋白表達水平均明顯高于pcDNA3.1 組和空白對照組（F = 1.013，P <0.001），見圖3。

圖3 Western blot 法檢測過表達IFITM2 蛋白的水平Fig.3 Determination of overexpression level of IFITM2 by Western blot

2.4 過表達IFITM2 對EMCV 體外增殖的影響pcDNA3.1-IFITM2 組及pcDNA3.1 組病毒粒子拷貝數(shù)分別為 1.614 51 × 105和 5.068 77 × 106，病毒滴度分別為 10-5.67和 10-6.68TCID50／ mL。pcDNA3.1-IFITM2 組的病毒粒子拷貝數(shù)及病毒滴度均顯著低于 pcDNA3.1 組（t 分別為 7.32 和 16.83，P 分別＜0.001 及＜0.05）。表明過表達IFITM2 可抑制EMCV在HEK293 細胞中的增殖。

2.5 HEK293 細胞中IFITM2 的抑制效果 siRNA001、siRNA002、siRNA003 及 siRNANC 組 HEK293 細胞中IFITM2 基因mRNA 轉錄水平分別為0.39、0.42、0.38、1.00，IFITM2 蛋白表達水平分別 0.36、0.32、0.28、1.00，見圖4。siRNA001、siRNA002、siRNA003組HEK293 細胞中IFITM2 基因mRNA 轉錄水平及蛋白表達水平均明顯低于siRNANC 組（F = 131.2，P ＜ 0.001）。表明靶向 IFITM2 的 siRNA 可有效干擾IFITM2 基因的轉錄和蛋白表達，3 種siRNA 序列的干擾效果差異無統(tǒng)計學意義（F=9.024，P ＞ 0.05），因此，用其混合液（siRNAMix）和siRNANC 分別轉染HEK293 細胞，用于后續(xù)試驗。

圖4 Western blot 法檢測 HEK293 細胞中 IFITM2 的抑制情況Fig.4 Western blotting of IFITM2 inhibition in HEK293 cells

2.6 IFITM2 下調(diào)對EMCV 體外增殖的影響 si-RNAMix 組和siRNANC 組病毒粒子拷貝數(shù)分別為1.23 × 106和 6.38 × 104，病毒滴度分別為 10-7.79和10-6.11TCID50／ mL。siRNAMix 組的病毒粒子拷貝數(shù)及病毒滴度均明顯高于siRNANC 組（t 分別為8.193 和 5.622，P 均 ＜ 0.001）。提示 HEK293 細胞中敲低IFITM2 可顯著促進EMCV 增殖。

2.7 IFITM2 過表達對EMCV 吸附及進入的影響pcDNA3.1-IFITM2 組與pcDNA3.1 組的吸附病毒粒子數(shù)分別為 3.303 × 105和 3.440 × 105，進入病毒粒子數(shù)分別為1.38×106和3.45×106。pcDNA3.1-IFITM2 組與pcDNA3.1 組的吸附病毒粒子數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（t = 0.499 8，P ＞ 0.05），pcDNA3.1-IFITM2 組的進入病毒粒子數(shù)明顯低于pcDNA3.1組（t=7.026，P ＜ 0.01）。表明 IFITM2 蛋白對 EMCV的吸附過程無影響，但可有效抑制病毒的進入過程。

3 討 論

先天性免疫是機體抵抗病毒感染的第一道防線，干擾素作為重要的抗病毒因子，具有廣譜抗病毒作用。病毒感染機體后激活宿主先天免疫，進而產(chǎn)生大量炎癥因子和干擾素刺激基因，發(fā)揮抗病毒作用。有報道表明，IFITM2 作為干擾素刺激基因的一種，可抑制多種病毒復制［18］。本研究結果表明，HEK293 細胞中過表達IFITM2 可顯著抑制EMCV增殖（P ＜ 0.05），同時下調(diào) IFITM2 后可促進 EMCV的增殖（P ＜ 0.001），IFITM2 對 EMCV 的抑制主要發(fā)生在病毒感染早期的進入過程，對吸附過程無影響。

早期研究發(fā)現(xiàn)，IFITM2 和IFITM3 可限制HIV-1的進入［19］，同時IFITM2 還可通過阻止病毒膜與核內(nèi)體融合，從而限制裂谷熱病毒（rift Valley fever virus，RVFV）的感染［20］；有研究通過進行單個病毒顆粒融合測定，表明IFITM 還可抑制內(nèi)體中融合孔的形成，阻止內(nèi)體中的病毒-細胞融合［21］，由此推測IFITM2抑制病毒增殖可能是通過抑制膜融合發(fā)揮作用。

另外，IFITM2 不僅可抑制RNA 病毒的復制，還可抑制DNA 病毒復制。有研究指出，IFITM2 可抑制PRV 在PK15 細胞中的復制，通過膽固醇途徑發(fā)揮作用［22］；對非洲豬瘟病毒（african swine fever virus，ASFV）的相關研究也發(fā)現(xiàn)，IFITM2 可通過改變膜融合和內(nèi)體膽固醇含量抑制病毒進人［23］。本研究表明，IFITM2 可抑制EMCV 在HEK293 細胞中的增殖，抑制病毒進入。結合上述研究結果推測，IFITM2 抑制病毒增殖可能與膜融合相關。本研究為后續(xù)深入研究IFITM2 抗病毒的作用機制奠定了基礎，也為相應抗病毒藥物研發(fā)提供了實驗依據(jù)。