李松林，韓 雪，李文娣，姜 山，王 旭

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension，下簡稱PH)作為高血壓疾病中的一種，此病可誘導(dǎo)右心衰竭甚至引起死亡的一種臨床疾病.在20世紀(jì)90年代初臨床上還沒有針對性的藥物，直到近些年才開發(fā)出一些藥物，但價(jià)格較為昂貴.而在不斷發(fā)展的中醫(yī)藥技術(shù)過程中，體現(xiàn)出了多種優(yōu)勢，因此，在臨床上也越來越重視對中藥制劑的使用.

中醫(yī)認(rèn)為PH的病因以“痰濁”、“氣虛”、“血虛”、“血瘀”較為常見[1]，而其病因關(guān)鍵為宗氣不足為本，痰瘀阻滯為標(biāo)[2].在現(xiàn)代臨床中藥方劑中，尋找可以有效治療PH的藥物是更加安全有效的策略.葛根芩連湯出自《傷寒論》，其中以葛根為君藥；黃芩、黃連為臣藥；甘草為佐使藥.該方本用于治療表證誤下之后表邪未解、汗出而喘之證.但隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該方適用于“濕熱”、“痰瘀”、“血瘀”、“郁熱”等證，所以在治療高血壓疾病中發(fā)揮了顯著的療效，具有較高的開發(fā)前景.因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來探討葛根芩連湯對于PH治療的分子機(jī)理，為揭示葛根芩連湯的藥理作用提供參考.

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 葛根芩連湯中活性成分的篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索葛根芩連湯中四味中藥的活性成分，將篩選條件設(shè)置為口服生物利用度(oral-bioavailability，OB)≥30%、類藥性(durg-likeness，DL)≥0.18，基于數(shù)據(jù)庫中的ADME參數(shù)對檢索的活性成分篩選，并通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)一步確定藥物活性成分，最后獲得活性成分的靶點(diǎn)蛋白.為了將蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化通過使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)篩選物種人為加以標(biāo)定.

1.2 PH相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索關(guān)鍵詞“pulmonary hypertension”，選取Relevance score高于10的靶點(diǎn)，得到PH相關(guān)的靶點(diǎn).將PH相關(guān)靶點(diǎn)與葛根芩連湯相關(guān)靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，提取出共同的靶基因.

1.3 構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將獲得的葛根芩連湯中藥物的活性成分靶點(diǎn)與PH靶點(diǎn)的交集信息整理成Excel表格，并導(dǎo)入到Cytoscape3.7.1軟件中，調(diào)整節(jié)點(diǎn)的形狀與顏色便于區(qū)別，得到藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò).

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

通過使用在線工具STRING(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，選擇物種為Homo sapiens，并上傳藥物與疾病的共同靶基因，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因.

1.5 共同靶點(diǎn)的富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，篩選條件為物種為人同時(shí)閾值為P<0.05，進(jìn)行GO(Gene Ontology)生物學(xué)過程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信號(hào)通路富集分析.

1.6 成分靶點(diǎn)分子對接

對篩選所得的葛根芩連湯中藥物的核心活性成分與PH相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證.應(yīng)用ChemOffice軟件構(gòu)建活性成分的3D結(jié)構(gòu)來更直觀的顯示活性成分與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系圖，使其能量最小化并保存為*mol2格式；選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前五的靶點(diǎn)蛋白，并從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中獲得到靶點(diǎn)蛋白*PDB格式的3D結(jié)構(gòu)；采用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，再通過Auto Dock軟件使活性成分及靶蛋白轉(zhuǎn)換為*pdbqt格式，并運(yùn)行Vina軟件完成對接，最后再次使用PyMOL軟件將化合物與蛋白對接結(jié)果進(jìn)行分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 葛根芩連湯中活性成分的篩選與整理

葛根、黃芩、黃連、甘草在TCMSP中檢索得到489個(gè)化合物，其中葛根有18個(gè)，黃芩有143個(gè)，黃連有48個(gè)，甘草有280個(gè).通過設(shè)置篩選條件為OB≥30%同時(shí)滿足DL≥0.18，篩選得到146個(gè)活性成分，其中葛根4個(gè)，黃芩36個(gè)，黃連14個(gè)，甘草92個(gè).查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[3]，puerarin、daidzein、daidzin、genistein、sitogluside、scoparone也為其主要活性成分.統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)方劑中四味藥材所含的活性成分存在交集，見圖1，葛根芩連湯中部分化合物基本信息見表1.

圖1 葛根芩連湯中藥材的活性成分關(guān)系圖

表1 葛根芩連湯中部分化合物基本信息

2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)的篩選

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫收集到葛根芩連湯中146個(gè)化合物所對應(yīng)的靶點(diǎn)共274個(gè)；使用GeneCards數(shù)據(jù)庫選取評(píng)分高于10分的PH靶點(diǎn)974個(gè)；將葛根芩連湯和PH的靶點(diǎn)取交集后，得到112個(gè)共同靶點(diǎn)(圖2)，可能為葛根芩連湯治療PH的關(guān)鍵靶點(diǎn).

圖2 葛根芩連湯-肺動(dòng)脈高壓共同靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 葛根芩連湯-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

葛根芩連湯-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖如圖3所示.

其中倒三角形節(jié)點(diǎn)表示為共同靶點(diǎn)，圓形節(jié)點(diǎn)表示活性化合物，正方形節(jié)點(diǎn)表示葛根芩連湯中的四味中藥；每條邊則表示兩個(gè)節(jié)點(diǎn)間存在相互作用關(guān)系.根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，對于一些連接關(guān)系較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中可能是關(guān)鍵的化合物或者靶點(diǎn).從化合物的角度分析，作用靶點(diǎn)數(shù)大于10的化合物有28個(gè)，排名前五的化合物分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山奈酚、MOL000481-染料木黃酮、MOL000390-黃豆苷元、MOL000173-漢黃芩素.從靶點(diǎn)的角度分析，能與10個(gè)以上的化合物作用的靶點(diǎn)有13個(gè)，排名前五的靶點(diǎn)蛋白分別是PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG、PTGS1.

圖3 葛根芩連湯藥材-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

從STRING數(shù)據(jù)庫中獲取到共同靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4，該網(wǎng)絡(luò)中包含112個(gè)節(jié)點(diǎn)(包含一個(gè)有利節(jié)點(diǎn))和2 295條邊，其中各靶點(diǎn)的相連節(jié)點(diǎn)數(shù)見圖5，排名前五的靶點(diǎn)分別是INS、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3.

圖4 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)

2.5 共同靶點(diǎn)的富集分析

應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的GO功能富集分析，結(jié)果顯示共有160個(gè)條目(P<0.05)，其中包括115個(gè)生物學(xué)過程(BP)條目，21個(gè)細(xì)胞組成(CC)條目，24個(gè)分子功能(MF)條目，見圖6.

圖6 共同靶點(diǎn)的GO功能分析

KEGG分析結(jié)果顯示有103條信號(hào)通路(P<0.05)，其中包括HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等，其中HIF-1信號(hào)通路涉及EGFR、IL6、ERBB2、STAT3、TIMP1、AKT1、MAPK1、CDKN1A、HIF1A等靶點(diǎn).選取P值較小的20個(gè)通路進(jìn)行可視化分析，具體結(jié)果見圖7.

圖7 共同靶點(diǎn)的KEGG富集分析:(A:KEGG-P值和基因數(shù)目；B：KEGG-基因)

2.6 葛根芩連湯中活性成分作用與核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

在“葛根芩連湯-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析中，根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計(jì)算得出排名前10的核心化合物與PPI網(wǎng)絡(luò)中前十的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，分子對接結(jié)果見圖8，結(jié)果顯示，配體與受體結(jié)合能量影響著結(jié)合構(gòu)象的穩(wěn)定性，其能量越低，穩(wěn)定性越高，相互作用的可能性也隨之變大.本實(shí)驗(yàn)中選取的葛根芩連湯化合物與PH共同靶點(diǎn)的結(jié)合能均為負(fù)值，皆在-6.72～-37.8 kJ·mol-1范圍內(nèi)，提示化合物與受體有一定的結(jié)合活性.由圖9可直觀的展現(xiàn)出部分活性化合物與受體分子對接模式，證明了葛根芩連湯的活性成分與PH相關(guān)的靶標(biāo)蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合活性.

圖8 葛根芩連湯對肺動(dòng)脈高壓作用靶點(diǎn)分子對接的結(jié)合能

圖9 部分活性化合物與受體分子對接模式

3 討 論

肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，通常認(rèn)為靜息狀態(tài)下平均肺動(dòng)脈壓≥3.325 Pa即為肺動(dòng)脈高壓.從中醫(yī)角度來說肺動(dòng)脈高壓的病因主要是以宗氣不足為本，痰瘀阻滯為標(biāo)[4].因此，臨床治病應(yīng)以補(bǔ)益宗氣、活血化瘀為主.葛根芩連湯作為中醫(yī)藥中的經(jīng)典方劑，主成分也很常見包括葛根、黃芩、黃連、甘草.這四味藥的主要化學(xué)成分研究也比較多，例如葛根中的葛根素、黃連中的小檗堿、黃芩中的漢黃芩素、甘草中的甘草醇等.有研究表明[5]葛根素對缺氧性肺動(dòng)脈高壓具有一定作用，黃連中的小檗堿對肺小動(dòng)脈收縮也有一定抑制作用[6].目前葛根芩連湯在臨床上應(yīng)用廣泛，在多種疾病中都具有一定療效，包括對心血管疾病的治療.

本次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對葛根芩連湯治療肺動(dòng)脈高壓的可能作用機(jī)制進(jìn)行了預(yù)測，共得到146個(gè)主要活性成分，112個(gè)共同作用靶點(diǎn)，160條生物過程和103條信號(hào)通路.其中，葛根芩連湯的主要活性成分可能是槲皮素、百蕊草素Ⅲ、金雀異黃素、黃豆苷元、漢黃芩素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黃素、葛根素、異黃酮等.另有研究表明，槲皮素可以通過改善肺血管重構(gòu)達(dá)到降壓的效果[7].此外，柚皮素通過顯著增加l -精氨酸達(dá)到肺動(dòng)脈高壓的改善作用[8].金雀異黃素可能通過PI3K/Akt-eNOS來改善肺動(dòng)脈高壓[9].葛根素可能通過抑制自噬阻止低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展[10].通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，從葛根芩連湯中篩選出了對治療肺動(dòng)脈高壓的重要靶點(diǎn)，主要有INS、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3、PTGS2、EGF、JUN、MAPK8等作用靶點(diǎn).IL6作為重要的炎癥因子，在肺動(dòng)脈高壓中具有高表達(dá)性[11]，可進(jìn)一步引起肺血管內(nèi)皮的損傷，增加血管的阻力，加重病情.VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子，對血管內(nèi)皮功能具有非常重要的影響，在肺動(dòng)脈高壓中也有著一定的作用[12].JUN作為重要的調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞的多種活動(dòng)，對細(xì)胞的多種生命活動(dòng)過程都具有影響[13].通過KEGG通路富集分析篩選得到103條信號(hào)通路，涉及到的HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等通路.HIF-1作為缺氧誘導(dǎo)因子，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，其對肺動(dòng)脈高壓具有一定影響，尤其對缺氧性肺動(dòng)脈高壓影響顯著.MAPK1參與生長因子的信號(hào)傳遞，對細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等多種生命活動(dòng)具有重要的意義[14].TNF信號(hào)通路可以通過促進(jìn)IL6表達(dá)，加重血管內(nèi)皮的損傷，影響細(xì)胞的增殖和調(diào)控，使血管阻力增加，加快了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展進(jìn)程[15].因此，葛根芩連湯可能通過對細(xì)胞增殖及炎癥等多方面的影響，來改善肺動(dòng)脈高壓的發(fā)展過程.

利用AutoDock Vina軟件對篩選得到的排名靠前的活性成分及靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，提示篩選出的潛在靶點(diǎn)和活性成分結(jié)合性較高，驗(yàn)證了運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對葛根芩連湯治療肺動(dòng)脈高壓的機(jī)制進(jìn)行了初步探討的可靠性.

綜上所述，葛根芩連湯對肺動(dòng)脈高壓病具有多靶點(diǎn)、多通路的治療優(yōu)勢，但信號(hào)通路及靶點(diǎn)之間的聯(lián)系還需要具體實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探討，以便于更好的應(yīng)用到臨床等相關(guān)研究中.