滕 剛，任皓威，趙添玉，商佳琦，劉 寧

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室 哈爾濱150030）

牛初乳是從正常分娩后3 d 的奶牛體內(nèi)分泌出來的乳汁。牛初乳中富含多種營養(yǎng)成分，各種免疫刺激及生長因子，其在動物以及人類健康管理中的作用受到社會各界的廣泛關(guān)注[1-2]。

有研究發(fā)現(xiàn)，牛初乳的營養(yǎng)成分和免疫組成與常規(guī)牛乳大不相同。在乳汁生成和哺乳期之前，成纖維細(xì)胞就進(jìn)行初乳分泌[3-5]。牛乳和初乳被認(rèn)為是重要的天然生物活性成分的來源。牛乳獲得的多肽具有多種生物學(xué)功能，其主要功能之一就是抗高血壓[6]。高血壓是困擾全球各國的嚴(yán)重問題，它是引起心腦血管疾病以及腎臟發(fā)病機(jī)率和死亡率的重要原因之一。研究人員對于牛乳及牛初乳的抗高血壓作用機(jī)制及效果開展了廣泛研究，例如干酪來源的肽可以使自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓降低7.1～29.3 mmHg，脫脂發(fā)酵乳使志愿者的收縮壓降低4.6～14.1 mmHg，不同食物來源的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制肽也具有降低血壓的作用[7-13]。

牛初乳中含有一些低分子質(zhì)量肽類的降血壓活性物質(zhì)，研究表明，可運(yùn)用超濾、離子交換層析及凝膠過濾層析等技術(shù)對牛初乳中抗高血壓因子（antihypertensive factor in bovine colostrums，AFBC）進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示，AFBC 能夠降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓，且對正常血壓的Wistar 大鼠沒有影響[13]。為了進(jìn)一步探究AFBC 的降血壓機(jī)理，本試驗采用Fura-2/AM 鈣熒光指示劑對急性分離成年大鼠的心肌細(xì)胞染色，應(yīng)用熒光分光光度計測定AFBC 與鈣離子通道阻斷劑--維拉帕米（Ver）對成年大鼠心肌細(xì)胞鈣濃度的作用機(jī)制。

目前，國內(nèi)外對乳源降血壓肽的作用機(jī)理研究主要集中于動物體內(nèi)降血壓作用以及對血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用，尚無文獻(xiàn)報道阻斷鈣離子通道，抑制心肌細(xì)胞鈣內(nèi)流的機(jī)理研究，本研究也為乳源降血壓肽的作用機(jī)理研究提供了新思路。

1 試驗材料

1.1 試驗藥物

按照文獻(xiàn)[13-14]方法分離純化牛初乳中抗高血壓因子（AFBC），試驗之前用生理鹽水配制成所需濃度；用維拉帕米（Ver）進(jìn)行注射，試驗所用的Ver 購于上海禾豐制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗動物

選取體重在200～250 g 之間的Wistar 大鼠，雌雄隨機(jī)。大鼠購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所。

1.3 試劑及儀器

2-[6-雙乙酸基-5-（2-雙乙酸氨基）-5-甲苯氧乙氧基]-2-苯駢呋喃基-5-惡唑羧酸五鉀鹽/乙酰羥甲基酯 （Fura-2/AM），Anaspec of America公司；Triton X-100，Sigma 公司；DMEM （高糖），Gibco 產(chǎn)品；胰蛋白酶；EGTA 和二甲基亞砜（DMSO），Solarbio 公司；牛血清白蛋白（BSA），Sigma 公司；熒光分光光度計（F-4500 型），日立公司；倒置顯微鏡，Leica 公司；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器；恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，香港力康公司；低速離心機(jī)，上海離心機(jī)械研究所。

2 試驗方法

2.1 成年大鼠心肌細(xì)胞分離[15]

運(yùn)用改進(jìn)Langendorff 灌流的方法進(jìn)行試驗操作。對大鼠進(jìn)行解剖后，迅速取出大鼠心臟，放入 冰D-Hank’s 液 （NaCl 8.00 g、KCl 0.40 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、KH2PO40.06 g 和NaHCO30.35 g，用少許雙蒸水溶解NaHCO3，并將pH 值調(diào)整至7.4 后，加入雙蒸水直至1 000 mL）中，將主動脈掛到實(shí)驗室自制Langendorff 裝置后，灌入37 ℃D-Hank’s 液，將心臟內(nèi)的淤血排出[16]。5 min 后，換37 ℃的0.1%胰蛋白酶液對心臟進(jìn)行灌流直至心臟發(fā)白，即停止消化。加入37 ℃的D-Hank’s 液灌流，將殘留于心臟中的酶洗凈。剪下心室，將其放入含10%牛血清的D-Hank’s 液，剪刀剪碎，用滴管吹打，取上清，繼續(xù)用D-Hank’s 液吹打，直至上清液不渾濁，停止吹打。將吹打后的上清合并，實(shí)驗室采用200 目尼龍網(wǎng)過濾后，再將濾液離心，離心條件為1 000 r/min，5 min，保留一半上清，同時加入Hank’s 液（NaCl 8.00 g、KCl 0.40 g、Ca-Cl20.14 g、MgSO4·7 H2O 0.20 g、Na2HPO4·H2O 0.06 g、KH2PO40.06 g、NaHCO30.35 g 和葡萄糖1.00 g，溶解于較少雙蒸水，并調(diào)整溶液pH 為7.4，加入雙蒸水的量為1 L）沖洗2 次，用DMEM 培養(yǎng)液（含10%牛血清）調(diào)整細(xì)胞數(shù)為109/L。

2.2 Fura-2/AM 負(fù)載

將Fura-2/AM 溶解在DMSO 中，將制備的細(xì)胞懸浮液加入到體系中，并將溶液的最終濃度調(diào)節(jié)至5 μmol/L，將混合物在37 ℃下恒溫振蕩45 min，并將上清液離心。用含有0.2%BSA 的Hanks溶液沖洗2 次。取1 滴懸液進(jìn)行觀察，直至對臺盼藍(lán)拒染。將其余懸液調(diào)細(xì)胞數(shù)為109/L 用于熒光測定[17]，并在細(xì)胞懸液中加入相應(yīng)濃度藥物。

2.3 熒光測定和心肌[Ca2+]i 的計算[17]

測量Fura-2 的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗室使用Hitachi F-4500 熒光雙波長分光光度計。在5 nm 激發(fā)光柵和10 nm 發(fā)射光柵且溫度為 （37±1）℃的條件下，將固定量（n≥106）的Fura-2/AM 細(xì)胞懸浮液加入熒光杯中。波長設(shè)定：激發(fā)光波長300～450 nm，發(fā)射波長500 nm，設(shè)定后掃描，當(dāng)熒光峰值達(dá)到最高時檢查Fura-2 的激發(fā)波長，并根據(jù)上述試驗步驟確定細(xì)胞負(fù)荷即可。載荷條件最佳時對應(yīng)的激發(fā)波長峰值約為340 nm。

將測定方式轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)陽離子濃度掃描（波長變換間隔2 s），雙波長測定繼續(xù)按照上述參數(shù)設(shè)置。在測定過程中，根據(jù)實(shí)際需求向儀器進(jìn)樣小孔加入KCl、TritonX-100 和EGTA。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度（[Ca2+]i）按照Grynkiewicz 等[18]提出的方法進(jìn)行計算。

Fura-2/AM 檢測[Ca2+]i的計算公式如下：

[Ca2+]i= Kd[（R-Rmin）/（Rmax-R）]（Fmin/Fmax）

其中，Kd表示Fura-2 和Ca2+反應(yīng)的解離常數(shù)，數(shù)值為224 nmol/L；R 代表各檢測點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，比率為F340/F380。通過試驗獲得Rmax和Rmin，以表示熒光比（F340/F380）。Fmax和Fmin表示測量的最大和最小熒光比，代表分別加入0.1% Tritonx-100和5 mmol/L EGTA（即在Ca2+飽和和零條件下）后獲得的細(xì)胞懸浮液，在380 nm 激發(fā)光下測得的Fura-2 熒光強(qiáng)度 （F380）。實(shí)際計算由Hitachi F-4500 鈣測量系統(tǒng)的鈣定量軟件自動確定。

3 試驗結(jié)果

3.1 成年大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

典型的急性分離的成年大鼠心肌細(xì)胞是桿狀的，長∶寬約3∶1～6∶1，體積越大，橫紋越明顯[15]。圖4顯示在40×顯微鏡下急性分離成年大鼠心肌細(xì)胞。

3.2 Fura-2/AM 負(fù)載情況

Fura-2/AM 不具有與Ca2+結(jié)合的能力，但是固定發(fā)射波長達(dá)510 nm，并且Fura-2/AM 的熒光峰值達(dá)到其最大值的時候，激發(fā)波長約為380 nm；如果其激發(fā)波長不在380 nm 而在340 nm，則意味著Fura-2/AM 進(jìn)入胞內(nèi)后，可被完全胞漿酶水解形成Fura-2 并與Ca2+相結(jié)合，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 Ca2+結(jié)合之前激發(fā)波長掃描圖譜Fig.1 Excitation wavelength scan of Ca2+-free

3.3 AFBC 對靜息狀態(tài)下心肌[Ca2+]i 的影響

用本法測得靜息狀態(tài)下心肌[Ca2+]i為（153.6±12.9）nmol/L，分別加入AFBC 0.5 mg/mL 和Ver 0.5 μmol/L 5 min 后，測得靜息狀態(tài)下的心肌[Ca2+]i分別為（139.8±13.7）nmol/L 和（151.8±16.2）nmol/L。喂藥前后進(jìn)行對比，結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05，n=6）。

3.4 AFBC 對KCl 引起心肌[Ca2+]i 變化的影響

對負(fù)載細(xì)胞以Hank’s 液懸浮（細(xì)胞外鈣濃度為1.3 mmol/L）時，50 mmol/L KCl 可使大鼠心肌[Ca2+]i達(dá)到（441.2±78.5）nmol/L（見圖3，與靜息組相比，P＜0.001）；用無鈣D-Hank’s 液來懸浮負(fù)載細(xì)胞，加入50 mmol/L KCl 時心肌[Ca2+]i為（159.8±10.3）nmol/L（與靜息狀態(tài)相比，P＞0.05）。同一動物心肌細(xì)胞先加入AFBC 0.5 mg/mL 和Ver 0.5 μmol/L 5 min 后，再加入同一濃度的KCl，心肌[Ca2+]i分別為（317.6±51.3）nmol/L 和（279.4±48.7）nmol/L （與單用KCl 組相比，AFBC 組P＜0.05，Ver組P＜0.001，n=6）。

4 討論

心肌收縮力的中心調(diào)節(jié)劑是細(xì)胞內(nèi)Ca2+。心室肌細(xì)胞Ca2+調(diào)節(jié)變化的重要性日益增加，因其可能對心臟的機(jī)械功能產(chǎn)生障礙和導(dǎo)致與充血有關(guān)的心律失常，進(jìn)而引起有關(guān)心臟病的發(fā)生。高血壓心肌持續(xù)的機(jī)械應(yīng)力與多種因素相關(guān)，其中主要包括心肌細(xì)胞的Ca2+敏感性和信號級聯(lián)放大反應(yīng)。

圖2 Ca2+結(jié)合之后激發(fā)波長掃描圖譜Fig.2 Excitation wavelength scan of Ca2+-bound

圖3 靜息組[Ca2+]i 隨時間變化的曲線Fig.3 Curve of time-concentration of contrast group’s [Ca2+]i

圖4 成年大鼠心室肌細(xì)胞（×400）Fig.4 Adult rat ventricular myocytes （×400）

本試驗測得成年大鼠心肌[Ca2+]i為 （153.6±12.9）nmol/L，與文獻(xiàn)[17]Ver 0.5 μmol/L 對靜息狀態(tài)下的心肌[Ca2+]i并無影響，其結(jié)果與文獻(xiàn)表述相同。AFBC 0.5 mg/mL 對靜息狀態(tài)下心肌[Ca2+]i也無明顯影響，但是使心肌[Ca2+]i有下降的趨勢，應(yīng)進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。當(dāng)鉀濃度高時，細(xì)胞膜上的電壓依賴性鈣通道（VDC）打開并發(fā)生鈣流入。從試驗結(jié)果來看，當(dāng)鉀濃度高時，大鼠心肌細(xì)胞[Ca2+]i明顯增加。[Ca2+]i不會隨著鉀含量的增加而提高，該試驗結(jié)果也說明，由于鉀含量增加引起的心肌細(xì)胞鈣離子濃度升高這一現(xiàn)象是由于細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流所引起的。試驗過程中AFBC 0.5 mg/mL 與Ver 可顯著抑制高鉀所致的[Ca2+]i升高，從而證明AFBC 對VDC 具有抑制作用，可抑制因VDC 開放而導(dǎo)致的鈣內(nèi)流現(xiàn)象，減少心肌[Ca2+]i。AFBC 抗高血壓的機(jī)理是通過抑制心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而使心肌收縮的現(xiàn)象得到抑制。然而導(dǎo)致上述結(jié)果出現(xiàn)的詳細(xì)原因仍不清楚，還有待進(jìn)一步研究。

值得注意的是，由于高血壓藥物在治療過程中仍然存在諸多不足之處，因而要禁止濫用抗高血壓藥物。AFBC 是一種抗高血壓因子，來源于初乳，是機(jī)體在免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，目前的研究并不知道AFBC 具有毒副作用，因此它可以作為人類抗高血壓干預(yù)的有效物質(zhì)。

本試驗測定[Ca2+]i結(jié)果可能受以下因素的影響：

1）房室化 當(dāng)部分Fura-2/AM 侵入亞細(xì)胞器（如胞漿網(wǎng)，細(xì)胞核等部位）的時候，F(xiàn)ura-2/AM在這些細(xì)胞器中不會被完全水解成Fura-2'，雖然其與Fura-2 的熒光相類似，但是并沒有與Ca2+結(jié)合的能力，因而會影響最終測定結(jié)果[19]。這種情況的發(fā)生與細(xì)胞的種類和測定[Ca2+]i條件有關(guān)，尤其是處于培養(yǎng)條件下的細(xì)胞。因此本試驗采用的是急性分離大鼠心肌細(xì)胞測定。

2）Fura-2 外漏 細(xì)胞內(nèi)存在的Fura-2 可通過某些途徑漏到胞外，例如以膜上親水性離子通道的途徑漏到細(xì)胞外部，從而使胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度降低，同時漏到胞外的Fura-2 也會造成一定的測量誤差。0.2%牛血清白蛋白可減少Fura-2 外漏。一般認(rèn)為，控制孵育時間小于1 h 也是減少Fura-2 外漏的有效措施[20]。

3）細(xì)胞懸液測量整個照射范圍內(nèi)所有細(xì)胞的熒光平均值，但這些細(xì)胞的功能活性不同步。因此，該測定結(jié)果不如單個細(xì)胞好，并且在每個細(xì)胞中顯示Ca2+，特別是在添加刺激劑或藥物后，其對結(jié)果具有更大的影響。

目前，雖然世界上研究通過評估食物來源的蛋白多肽的抗高血壓作用機(jī)制方法仍然很少，但是這些研究指出了NO 和前列腺素通路中的不同分子靶點(diǎn)。此外，還有研究揭示了抗高血壓LF 的作用復(fù)雜性，開辟了更好的途徑了解其降血壓效果。毫無疑問，這些技術(shù)應(yīng)用于不同的體外和體內(nèi)研究模型，將大大增強(qiáng)目前關(guān)于抗高血壓肽的作用機(jī)制的研究[21-22]。