劉 瑞，李睿智，王 嵬，儀淑敏*，勵(lì)建榮，李學(xué)鵬，徐永霞

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心國家魚糜及魚糜制品加工技術(shù)研發(fā)分中心 遼寧錦州121013 2 渤海大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心 遼寧錦州121013）

鰱魚（Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix），脊索動(dòng)物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鰱屬，是著名的四大家魚之一，產(chǎn)量僅次于草魚，2019年年產(chǎn)值381.03 萬t[1]。鰱魚中含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和多種不飽和脂肪酸，包括8 種必需氨基酸和組氨酸，其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的含量達(dá)到海水魚標(biāo)準(zhǔn)；鰱魚中還含有鉀、鈉、鈣、鎂、磷等常量元素以及鋅、硒、鐵等微量元素[2-3]。其肉薄刺多，土腥味較重，市場上主要以活體的銷售為主，部分鰱魚被加工成凍品魚片、魚粉制品及魚丸，使用率不高，還造成很多的垃圾，破壞環(huán)境，資源浪費(fèi)嚴(yán)重[4]，消費(fèi)者接受程度低于其它水產(chǎn)品。通過加工成魚糜制品，可提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值[5]。

魚糜制品在凍藏過程中易腐敗變質(zhì)。其腐敗機(jī)制涉及生物、化學(xué)、物理等變化，其中，微生物是引起腐敗的主要因素，特別是新鮮和冷凍食品，由于未經(jīng)過高溫處理或其它處理方式消毒，附著在食品中的微生物生長繁殖，最終導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)[6]。Lücking 等[7]對369 種腐敗的食品樣品的研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌占主導(dǎo)地位，還檢測到少數(shù)的海水芽胞八疊球菌，同時(shí)證明地衣芽胞桿菌具有一定的蛋白水解酶活性，能夠分解利用蛋白質(zhì)。本團(tuán)隊(duì)以往的研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌是造成鰱魚糜制品腐敗的優(yōu)勢腐敗菌之一[8]。1945年，瑞士Rose 等[9]在地衣芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶，它是一類在堿性條件下能夠水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類。趙巧靈[10]利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究金槍魚在冷藏過程中的品質(zhì)變化，魚肉組織蛋白酶加速肌原纖維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)降解過程，破壞魚肉組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致魚肉品質(zhì)下降。

本試驗(yàn)中，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶對鰱魚肌原纖維蛋白的降解作用，尋找降解過程中的肌原纖維蛋白差異蛋白點(diǎn)，并利用GO 功能注釋及KEEG 通路分析鰱魚肌原纖維蛋白微生物降解的途徑，為今后鰱魚等水產(chǎn)品的微生物腐敗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活鰱魚購于遼寧省錦州市林西路水產(chǎn)市場，1 h 內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，立即冰水致死。

固相pH 值梯度 （immobilized pH gradient，IPG）預(yù)制干膠條（pH 4～7，17 cm）、載體兩性電解質(zhì)（pH 3～10、pH 5～8、pH 4～6 和pH 5～7）、Trisbase、苯甲基磺酰氟（PMSF）、尿素、硫脲、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）所需丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、礦物油、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、甘氨酸均購買自美國Bio-Rad 公司；甘油、溴酚藍(lán)、瓊脂糖均為國產(chǎn)分析純，所有溶液均以Milli-Q 超純水系統(tǒng)制備的超純水為溶劑。

1.2 儀器與設(shè)備

5800MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜儀，ABSCIEX 公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；MILLI-QREFERENC 超純水系統(tǒng)，美國密理博公司；GS-800-TM 校正型光密度掃描儀，美國Bio-Rad 公司；DL-1005 型低溫冷卻液循環(huán)系統(tǒng)，上海漢諾儀器有限公司；PROTEAN IEF 等電聚焦電泳儀，美國Bio-Rad 公司；PROTEAN83ⅡXL 電泳槽，美國Bio-Rad 公司；ZD-9556 型水平脫色搖床，常州市凱航儀器有限公司；FE20 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；SORVALL Stratos 冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

1.3.1.1 鰱魚肌原纖維蛋白提取 參考李學(xué)鵬等[11]的方法，取魚肉20 g 并絞碎。加入5 倍體積10 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.2），高速均質(zhì)2 min，每隔30 s，停30 s。在5 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min。取沉淀，在沉淀中加入3 倍體積的Tris-HCl （含0.6 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris，pH 7.2）緩沖液，高速均質(zhì)，后在4 500 r/min、4 ℃條件下離心15 min，雙縮脲法測定其濃度。取上清液貯藏在-80 ℃冰箱中備用。

1.3.1.2 堿性蛋白酶處理 將干酶粉稀釋至0.01 g/mL，并取20 mL 肌原纖維蛋白溶液，添加相當(dāng)于蛋白質(zhì)質(zhì)量0.1%的堿性蛋白酶酶液，置于磁力攪拌器上，分別在4 ℃和25 ℃下反應(yīng)。堿性蛋白酶處理時(shí)間分別為：4 ℃選取0，1，2 h；25 ℃選取0，0.5，1 h。反應(yīng)結(jié)束后立即加入適量50 mmol/L PMSF 抑制酶活。

1.3.2 雙向電泳

1.3.2.1 等電聚焦程序 參考Bio-Rad 公司雙向電泳操作技術(shù)手冊及本團(tuán)隊(duì)前期已探索出鰱魚肌原纖維蛋白的雙向凝膠電泳技術(shù)（two dimensional gel electrophoresis，2-DE）[12]進(jìn)行試驗(yàn)。將適量的已定量蛋白質(zhì)溶液與水化上樣緩沖液（含7 mol/L尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、0.2%載體兩性電解質(zhì)和0.001%溴酚藍(lán)）充分混合，采用17 cm，pH 4～7 的IPG 預(yù)制干膠條進(jìn)行等電聚焦，100 μg，300 μL 主動(dòng)水化上樣，顯色方式為硝酸銀染色。等電聚焦程序參數(shù)設(shè)置如表1所示。

表1 等電聚焦程序參數(shù)設(shè)置（20 ℃）Table 1 Setting of IEF parameters （20 ℃）

1.3.2.2 膠條平衡 等電聚焦結(jié)束后，每根膠條用6 mL 膠條平衡緩沖液Ⅰ〔6 mol/L 尿素、2%SDS、0.375 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、20%甘油和2% DTT〕和緩中液Ⅱ[6 mol/L 尿素、2%SDS、0.375 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、20%甘油和2.5%碘乙酰胺]進(jìn)行膠條平衡，每次14 min。

1.3.2.3 第二向SDS-PAGE 垂直凝膠電泳 將平衡完畢的膠條于1×電極緩沖液 （含3 g/L Trisbase、14.4 g/L 甘氨酸、1 g/L SDS）中洗去多余平衡液，分別轉(zhuǎn)移至提前制好的第二向10%，12%，15%聚丙烯酰胺分離膠上端，并加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點(diǎn)瓊脂、25 mmol/L Tris-base、192 mmol/L 甘氨酸、0.1% SDS 和0.001%溴 酚藍(lán)），排除氣泡，待其徹底凝固后，轉(zhuǎn)移至垂直電泳槽中，恒壓進(jìn)行第二向SDS-PAGE，程序見表2。

1.3.2.4 銀染、凝膠成像及分析 采用參考文獻(xiàn)[13-15]的方法并略有修改。將銀染后的凝膠轉(zhuǎn)至GS-800 凝膠掃描成像儀投射平臺(tái)上。

采用PDQuest 8.0 二維凝膠圖像專業(yè)分析軟件對所得圖像進(jìn)行背景消減、蛋白點(diǎn)檢測和匹配等處理，尋找差異蛋白點(diǎn)。

1.3.3 差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

1.3.3.1 酶解 參考Addis 等[16]和Bernevic 等[17]的方法，從銀染的凝膠上得到蛋白質(zhì)點(diǎn)，放入硅化處理過的1.5 mL 微量離心管中，用超純水反復(fù)漂洗后，對該蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切。

1）脫色 在放有蛋白點(diǎn)的離心管中，加入50 μL 脫色液[15 mmol/L K3Fe（CN）6溶于50 mmol/L Na2S2O3中]，將蛋白點(diǎn)的棕色脫色至淡綠色，用超純水漂洗以終止反應(yīng)，直至蛋白點(diǎn)變?yōu)闊o色透明。然后將蛋白點(diǎn)所附著的丙烯酰胺切碎，用100 mmol/L NH4HCO3漂洗，并用100%乙腈（色譜純）脫色至丙烯酰胺凝膠顏色變白，隨后將其置于冷凍真空干燥器中進(jìn)行凍干。

2）酶解 用pH 8.0 的胰蛋白酶液 （以50 mmol/L 碳酸氫銨溶液為溶劑）將凍干的樣品于37℃酶解過夜。每個(gè)蛋白點(diǎn)胰蛋白酶用量根據(jù)蛋白點(diǎn)大小，每個(gè)蛋白點(diǎn)約40～100 ng 胰蛋白酶。

3）萃取 酶解后的肽段用60 μL 5% TFA和50%乙腈進(jìn)行萃取，重復(fù)2 次，每次15 min，合并萃取液并真空抽干。

4）樣品復(fù)溶與脫鹽 采用0.1% TFA 溶液將干燥后的樣品再次復(fù)溶，并用Zip TIP 移液嘴脫鹽。將1 μL 除鹽后的樣品置于質(zhì)譜樣品板上進(jìn)行自然干燥，進(jìn)行MALDI-TOF/TOF 分析，檢測條件見表3。

1.3.3.2 質(zhì)譜測定 將酶解好的樣品用MALDITOF/TOF 質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems）對樣品進(jìn)行測定，選擇合適的儀器參數(shù)獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)至少為3 次平行試驗(yàn)的平均值。采用Origin9.0 繪圖，SPSS19.0 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.01 為極顯著，P<0.05 為顯著。多重比較采用Duncan 檢驗(yàn)。

表2 第二向SDS-PAGE 凝膠電泳程序Table 2 Parameters of second to SDS-PAGE program

表3 MALDI-TOF/TOF 檢測條件Table 3 The detecting conditions of MALDI-TOF/TOF

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚肌原纖維蛋白降解過程中的2-DE 圖譜

如圖1所示，隨著降解過程的進(jìn)行，0 h 時(shí)處理組蛋白點(diǎn)均較少，4 ℃-1 h 和25 ℃-0.5 h 時(shí)，蛋白點(diǎn)增多，同時(shí)低分子蛋白區(qū)出現(xiàn)蛋白點(diǎn)，表明肌原纖維蛋白被降解成小分子多肽或蛋白質(zhì)。隨后，在4 ℃-2 h 和25 ℃-1 h 時(shí)，蛋白點(diǎn)變得模糊，并發(fā)生拖尾等聚焦不徹底的情況。這可能是由于降解過程中蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集和氨基酸改性所致[18]。

利用PDQuest 軟件對4 ℃處理0，1，2 h 及25℃處理0，0.5，1 h 樣品的2-DE 圖譜進(jìn)行重復(fù)性和匹配率的檢測，對2-DE 圖譜蛋白點(diǎn)表達(dá)差異進(jìn)行比較分析。差異蛋白點(diǎn)檢測標(biāo)準(zhǔn)為：若某一個(gè)蛋白點(diǎn)在不同組之間的相對豐度的比值大于2，且t-test P<0.05，即認(rèn)為該點(diǎn)為差異蛋白點(diǎn)。經(jīng)過分析得到，4 ℃組和25 ℃組分別存在45 個(gè)、30 個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，如圖4所示。差異蛋白點(diǎn)的局部放大圖如圖2及圖3所示。

2.2 差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定及分析

圖1 鰱魚肌原纖維蛋白降解過程中蛋白質(zhì)圖譜變化（4 ℃，25 ℃）Fig.1 Changes of protein pattern of silver carp myofibrils during protein degradation （4 ℃，25 ℃）

圖2 4 ℃差異蛋白點(diǎn)部分放大圖Fig.2 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of degradation at 4 ℃

圖3 25 ℃差異蛋白點(diǎn)部分放大圖Fig.3 Local amplification of differentially expressed protein spots in the 2-DE maps of degradation at 25 ℃

在對如圖4所示的總計(jì)75 個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)割膠取點(diǎn)的過程中，刪除掉4 和25 ℃重復(fù)的點(diǎn)，以及割膠失敗的點(diǎn)，共獲得獨(dú)立可進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)點(diǎn)24 個(gè)。其中4 ℃組中共有14 個(gè)蛋白點(diǎn)，分別是點(diǎn)3504，0510，6406，3413，1005，1105，1410，0014，1012，0007，6512，5506，0116，6407；25℃組中共有10 個(gè)蛋白點(diǎn)，分別是2402，2304，5302，5104，2204，4108，0214，5503，5504，2203。對割膠成功的24 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切后質(zhì)譜鑒定，得到24 個(gè)蛋白點(diǎn)的肽指紋圖譜。

采用Mascot 軟件在NCBI 進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，當(dāng)?shù)鞍灼ヅ涠却笥?5%時(shí)認(rèn)為具有顯著性 （P<0.05）即具備可靠性。所得蛋白質(zhì)點(diǎn)Mascot 檢測結(jié)果如表4所示。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，檢測出的差異蛋白點(diǎn)主要有肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白及其相關(guān)蛋白，但出現(xiàn)多個(gè)蛋白點(diǎn)代表同一蛋白質(zhì)的現(xiàn)象。這可能是由于蛋白多種翻譯后修飾的結(jié)果[19]，仍需要進(jìn)一步研究。

圖4 鰱魚肌原纖維蛋白降解過程中差異蛋白點(diǎn)Fig.4 Differential protein spots in the degradation of silver carp myofibrillar protein

表4 蛋白質(zhì)點(diǎn)的肽指紋圖譜Mascot 檢索結(jié)果Table 4 Mascot search results of the PMF of protein spots

2.3 差異蛋白質(zhì)的功能分類

2.3.1 差異蛋白質(zhì)的細(xì)胞組成分類 表5列出的Level 9 級(jí)別的差異蛋白質(zhì)的細(xì)胞組成分類，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)主要以骨架結(jié)構(gòu)部分（cytoskeletal part）為主。收縮纖維部分（contractile fiber part）及肌原纖維（myofibril）各自包含1 個(gè)蛋白點(diǎn)，為點(diǎn)3504；中間絲骨架（intermediate filament cytoskeleton）包含2 個(gè)蛋白質(zhì)，分別為點(diǎn)5504 及6407；肌動(dòng)蛋白骨架（actin cytoskeleton）包含4 個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為3504，5503，5506，6512；骨架結(jié)構(gòu)部分（cytoskeletal part）包含6 個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為3504，5504，6407，5503，5506 及6512。表明在降解過程中，主要是肌原纖維蛋白的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。Ayala 等[20]發(fā)現(xiàn)鯛魚在0 ℃貯藏期間肌原纖維蛋白降解速度非?？欤渲兄饕羌?xì)胞骨架蛋白被降解。

表5 差異蛋白質(zhì)細(xì)胞組成分類Table 5 Cellular component classification of identified proteins

2.3.2 差異蛋白質(zhì)的分子功能分類 分析鰱魚肌原纖維蛋白質(zhì)組的功能情況，將差異蛋白質(zhì)進(jìn)行Level 8 級(jí)別上的基因本體的注釋，被分為3 個(gè)類別。從表6得知，ATPase 活性功能 （ATPase activity）包含1 個(gè)蛋白點(diǎn)，為點(diǎn)3504；肌動(dòng)活動(dòng)功能（motor activity）包含3 個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為：5503，5504，6512；腺嘌呤核苷酸結(jié)合功能 （adenyl ribonucleotide binding）包含4 個(gè)蛋白點(diǎn)，分別為點(diǎn)1012，3504，6512，1105。

2.3.3 差異蛋白質(zhì)的生物過程分類 利用GO 的功能對鑒定出的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行Level 5 級(jí)別上的生物過程分類和鑒定，見表7所示。差異蛋白質(zhì)可以被分為35 個(gè)生物途徑，其中，包含一個(gè)蛋白質(zhì)的生物過程有：肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)、肌肉系統(tǒng)過程、骨架結(jié)構(gòu)、有機(jī)氮化合物分解過程、雜環(huán)化合物分解過程、細(xì)胞成分形態(tài)、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)、含磷化合物代謝過程、有機(jī)環(huán)狀化合物應(yīng)激、細(xì)胞含氮化合物代謝過程、細(xì)胞器組裝、有機(jī)磷酸酯代謝過程、蛋白亞基組成復(fù)合體過程、嘌呤化合物代謝過程、脂類應(yīng)激、肌肉組織發(fā)育過程、芳香族化合物代謝過程、糖類衍生物代謝過程、糖基化合物分解過程、有機(jī)環(huán)狀化合物分解過程、細(xì)胞分化過程、細(xì)胞過程的負(fù)調(diào)控、含堿基化合物代謝過程、金屬離子應(yīng)激過程、循環(huán)系統(tǒng)過程、激素應(yīng)激過程、乙醇應(yīng)激過程、細(xì)胞凋亡規(guī)劃過程，共30 個(gè)生物過程，其包含的蛋白質(zhì)點(diǎn)均為點(diǎn)3504。

信號(hào)傳導(dǎo)過程包含1 個(gè)蛋白點(diǎn)0116；規(guī)范過程包含1 個(gè)蛋白點(diǎn)6512；微管發(fā)育過程包含3 個(gè)蛋白點(diǎn)2402，1410 及5302；胚胎發(fā)育過程包含4個(gè)蛋白點(diǎn)2402，1410，5302 及6512；組織形態(tài)形成過程和系統(tǒng)發(fā)育過程包含5 個(gè)蛋白點(diǎn)2402，1410，5302，4203 及3504；形態(tài)發(fā)育過程中的解刨學(xué)結(jié)構(gòu)形成過程包含6 個(gè)蛋白點(diǎn)2402，1410，5302，4203，6512 及3504。結(jié)果表明，這些蛋白點(diǎn)在降解過程中可能參與多種生物途徑，且1 個(gè)蛋白可能參與多個(gè)生物途徑。趙巧靈[10]在金槍魚冷藏過程中鑒定差異蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)有5 種關(guān)于肌原纖維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，分別是肌球蛋白重鏈-1、肌球蛋白輕鏈-1、肌球蛋白輕鏈-3、α-肌動(dòng)蛋白和β-肌動(dòng)蛋白。

表6 差異蛋白質(zhì)分子功能分類Table 6 Molecular function classification of identified proteins

2.4 差異蛋白點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

肌動(dòng)蛋白在體內(nèi)一般以球形肌動(dòng)蛋白（G-肌動(dòng)蛋白）和纖維性肌動(dòng)蛋白（F-肌動(dòng)蛋白）兩種形式存在，是構(gòu)成細(xì)胞骨架和肌小節(jié)的主要蛋白質(zhì)，主要參與肌肉收縮[21]。

肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)中結(jié)合位點(diǎn)較多，可與多種蛋白質(zhì)相結(jié)合，以發(fā)揮不同的細(xì)胞功能。它與肌球蛋白結(jié)合，使肌球蛋白ATP 酶的活性變大，為肌肉的運(yùn)動(dòng)提供能量，其與肌球蛋白相互作用，促使肌肉運(yùn)動(dòng)[22]。

在本研究中，被鑒定為肌動(dòng)蛋白及相關(guān)蛋白的蛋白點(diǎn)包括4 ℃組中的點(diǎn)0510，1410，3504，3413，1105，1005，0014 和6406，25 ℃組中的點(diǎn)2402，2304，5302 和4104。其中，4 ℃組中點(diǎn)0510，1410，3504，3413 出現(xiàn)下調(diào)，點(diǎn)1105，1005 和0015出現(xiàn)上調(diào)，而點(diǎn)6406 的豐度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；25 ℃組中點(diǎn)2402 和2304 出現(xiàn)下調(diào)，而點(diǎn)5302 和4104 的豐度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。表明在降解過程中，堿性蛋白酶破壞肌動(dòng)蛋白，使其被分解為多個(gè)基團(tuán)，而出現(xiàn)先上升后下降趨勢的蛋白點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究。

肌球蛋白在魚肌肉中含量約50%，而且它與肉的熱凝膠能力有著較為重要的關(guān)系[23]。肌球蛋白是一種大的不對稱分子，具有一條α-螺旋組成的螺旋狀頸部和2 個(gè)分子質(zhì)量為500 ku，具有ATPase 活性的球形頭部區(qū)域，總體而言，其包含2條重鏈（MHC）和4 條輕鏈（MLC）[24]。肌球蛋白具有兩種輕鏈，一種是調(diào)節(jié)輕鏈，其在磷酸化作用和去磷酸化作用中有著重要作用，另一種是基本輕鏈，同時(shí)也被稱為堿性輕鏈。肌球蛋白重鏈?zhǔn)枪趋兰〈旨〗z的重要組成單位，其表達(dá)量高低影響肌纖維的組成和肌肉生長[25]。肌球蛋白重鏈包括3 個(gè)結(jié)構(gòu)及功能不同的結(jié)構(gòu)域：頭部結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)最保守，它具有與ATP、肌動(dòng)蛋白結(jié)合的位點(diǎn)；結(jié)構(gòu)域?yàn)棣?螺旋的頸部，它通過與調(diào)節(jié)輕鏈亞基相結(jié)合來調(diào)節(jié)頭部的活性；尾部結(jié)構(gòu)域含有決定尾部是否與膜結(jié)合，還是與其它的尾部相結(jié)合的位點(diǎn)，由此它決定是否產(chǎn)生肌球蛋白二聚體或者肌球蛋白纖維。在本研究中，與肌球蛋白及相關(guān)蛋白質(zhì)有關(guān)的蛋白點(diǎn)有4 ℃組中的0007 和6512，在降解過程中，點(diǎn)0007 的豐度出現(xiàn)下調(diào)趨勢，而點(diǎn)6512 的豐度則呈現(xiàn)上升趨勢。

表7 差異蛋白質(zhì)生物過程分類Table 7 Biological process classification of identified proteins

同時(shí)，肌球蛋白重鏈可以被酶解為重酶解肌球蛋白和輕酶解肌球蛋白。重酶解肌球蛋白具有肌球蛋白全部的ATPase 活性[26]，輕酶解肌球蛋白則對細(xì)絲的形成有著重要作用[27]。在本研究中，質(zhì)譜鑒定結(jié)果為輕酶解肌球蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)的蛋白點(diǎn)包括4 ℃組中的點(diǎn)5006 和25 ℃組中的點(diǎn)5503，其豐度均在酶解過程中呈現(xiàn)上升趨勢，具體機(jī)制仍有待研究。

Hypothetical protein cypCar_00047572 （點(diǎn)0116）在降解過程中呈現(xiàn)上升趨勢，根據(jù)后面的GO 功能注釋得知，此蛋白點(diǎn)與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)；hypothetical protein cypCar_00035009（點(diǎn)6407）在降解過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，根據(jù)GO 功能注釋，此蛋白是中間絲骨架及骨架結(jié)構(gòu)部分的組成部分；hypothetical protein cyp-Car_00036471，partial（點(diǎn)5504）在降解過程中呈現(xiàn)上升趨勢，根據(jù)GO 功能注釋得知，此蛋白點(diǎn)同樣是中間絲骨架及骨架結(jié)構(gòu)部分的組成部分，同時(shí)其又與肌動(dòng)活動(dòng)功能有關(guān)；hypothetical protein cypCar_00048243（點(diǎn)4203）在降解過程中呈現(xiàn)上升趨勢，依據(jù)GO 功能注釋，此蛋白點(diǎn)參與組織形態(tài)形成過程、系統(tǒng)發(fā)育過程及形態(tài)發(fā)育過程中的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)形成過程。然而這4 個(gè)蛋白點(diǎn)相關(guān)研究較少，仍需進(jìn)一步研究。

2.5 差異蛋白質(zhì)代謝途徑

目前，關(guān)于水產(chǎn)品蛋白質(zhì)微生物降解機(jī)制研究較少，通過KEEG 代謝途徑分析無法找到肌原纖維蛋白的降解途徑。通過前文降解過程中生物信息學(xué)分析，可推測，在降解過程中，堿性蛋白酶將肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)展開，破壞其骨架，使肌動(dòng)球蛋白解體為肌動(dòng)蛋白及肌球蛋白。隨后，堿性蛋白酶主要作用于肌原纖維蛋白組分中的肌動(dòng)蛋白及肌球蛋白，分別將肌動(dòng)蛋白降解為肌動(dòng)蛋白的多個(gè)肽段，將肌球蛋白降解為肌球蛋白重鏈和輕酶解肌球蛋白。

3 結(jié)論

在4 ℃和25 ℃條件下，隨著堿性蛋白酶處理時(shí)間的增加，蛋白圖譜中蛋白點(diǎn)的數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。推測堿性蛋白酶降解肌原纖維蛋白的途徑可能是首先破壞肌原纖維骨架結(jié)構(gòu)，肌動(dòng)球蛋白解體為肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白，隨后，肌球蛋白及肌動(dòng)蛋白進(jìn)一步被分解為其它產(chǎn)物如肌球蛋白重鏈等。