閆艷華，曹慧慧，董李學(xué)，龐學(xué)良，谷守國，張麗芳，王巖，鄭百芹,3

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山063000；2.河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 唐山063000；3.唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北唐山063000）

0 引 言

生鮮乳（Raw Milk）是未經(jīng)殺菌、均質(zhì)等工藝處理的原奶的俗稱，是各大養(yǎng)殖場送往乳企前奶農(nóng)直接從牛體中獲得的原奶[1-2]。天然優(yōu)質(zhì)的原奶產(chǎn)自健康動物的乳房，整個生產(chǎn)過程必須規(guī)范操作，為了加強乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理，我國頒布了《乳品質(zhì)量安全監(jiān)督管理條例》和相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)等，不合格的原奶是不允許進入生產(chǎn)環(huán)節(jié)的[3-4]。生鮮乳處于乳制品供應(yīng)鏈的最上游，是目前限制我國乳業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的主要因素，為了保障生鮮乳的質(zhì)量安全，必須規(guī)范各擠奶環(huán)節(jié)并保證采奶器具的清潔。影響原奶質(zhì)量的微生物中數(shù)量最大的為細(xì)菌，因此研究奶牛養(yǎng)殖場中各采奶環(huán)節(jié)中細(xì)菌的多樣性與差異性對監(jiān)測原奶質(zhì)量、提高奶制品品質(zhì)及提高奶農(nóng)收益都具有重大意義。

1 實 驗

1.1 養(yǎng)殖場不同采樣點概況

實驗?zāi)翀鲞x取河北唐山地區(qū)規(guī)模較大的荷斯坦奶牛養(yǎng)殖場，選取3個對儲奶罐中生鮮乳質(zhì)量有直接影響的關(guān)鍵性采奶環(huán)節(jié)進行取樣，并以儲奶罐中的生鮮乳作為陽性對照。4個不同取樣點的具體編號分別為：C1（牛乳頭消毒前C1.1-C1.6）、C2（牛乳頭消毒后C2.1-C2.6）、E（采奶罩杯E1-E6）及M 1（儲奶罐奶M 1.1-M 1.6）。

1.2 樣品采集

選取河北唐山地區(qū)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場，在奶牛養(yǎng)殖場的擠奶廳對采奶環(huán)節(jié)中的不同取樣點分別進行采樣，牛乳頭消毒前、牛乳頭消毒后采樣：分別隨機選取6頭健康牛體并確保候選牛體乳房健康未見乳房炎，用無菌棉拭子對其乳頭周圍1 cm2的面積進行3次涂抹后迅速置于10 mL無菌生理鹽水中；采奶罩杯的采樣：擠奶廳隨機選取6個采奶罩杯用無菌棉拭子擦拭其內(nèi)表面后置于10 mL無菌生理鹽水中送測序；儲奶罐奶采樣：儲奶罐中的奶經(jīng)過攪拌混勻后用液態(tài)乳鏟斗從表面、中部、底部三點采樣，每個點采集1 L，3個點采集到的3 L樣品充分混合均勻后，取15 mL分別分裝至6個樣品采集管中送測序；所有樣品采集后，立刻置于液氮中保存。

1.3 細(xì)菌DNA提取和PCR擴增

按照細(xì)菌DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.Stool DNA Kit，Omega）說明書進行各樣點細(xì)菌總DNA抽提，以各樣點的DNA作為PCR模板，擴增16S rRNA基因的V3-V4區(qū)。PCR反應(yīng)的正反向引物分別為341F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'和806 R：3'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5'擴增后對PCR擴增產(chǎn)物進行純化后通過HiSeq2500平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析與過濾

委托華大基因通過HiSeq平臺進行測序，下機數(shù)據(jù)過濾采取按窗口去低質(zhì)量的方法：設(shè)置25 bp的窗口，如果窗口平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基；截短后的read長度低于原始read長度75%的，去掉整條序列。去除接頭污染的reads（默認(rèn)adapter序列有15 bp的overlap，設(shè)置為15 bp，允許錯配數(shù)為3），去除含N的reads，并去除低復(fù)雜度的reads（默認(rèn)reads中連續(xù)堿基長度≥10的為低復(fù)雜度reads），根據(jù)barcode和引物區(qū)分樣本，barcode序列與測序reads比對允許的錯配個數(shù)為0 bp。序列拼接使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags。拼接條件如下：①最小匹配長度15 bp；②重疊區(qū)域允許錯配率為0.1[5-7]。

1.5 OTUs與多樣性分析

利用UPARSE在97%相似度下進行聚類，得到OTU的代表序列，然后利用UCHIME（v4.2.40）將PCR擴增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列中去除，再使用usearch_global方法將所有Tags比對回OTU代表序列，得到每個樣品的OTU的豐度統(tǒng)計表。通過軟件USEARCH對拼接好的序列在97%相似度下進行聚類，得到OTU代表序列，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行物種分類分析。利用OTUs進行微生物多樣性分析[8-10]。

1.6 群落結(jié)構(gòu)組成分析

為了得到每個OTU對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并在界門綱目科屬種水平統(tǒng)計各樣本的群落組成。根據(jù)每個OTU中序列的條數(shù)得到OTU分布表，對物種進行豐度和熱圖進行分析[8,11-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列的拼接與組裝

測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表1，結(jié)果顯示通過對擠奶前3個不同取樣點及儲奶罐中奶的細(xì)菌基因組測序，4個樣品總計測得原始序列條數(shù)為1 152 394條，共產(chǎn)生9 029個OTU。其中E樣品中的OTU最多，達(dá)到了2 497個OTU，M 1樣品中的OTU最少，僅為2 047個OTU。OTU對應(yīng)的是物種分類信息，每個OTU對應(yīng)于一個不同細(xì)菌（微生物）種，通過OTU分析可以知道樣品中微生物多樣性和不同微生物的豐度。本研究中擠奶環(huán)節(jié)的4個不同取樣點中OTU含量最多的為E即采奶罩杯，說明采奶罩杯中的細(xì)菌豐度最高，細(xì)菌物種數(shù)最多；儲奶罐奶中OTU數(shù)目最少，推測可能由于生奶經(jīng)過低溫管道流入儲奶罐的過程中部分細(xì)菌受低溫影響無法存活；采奶罩杯是奶牛養(yǎng)殖場采奶環(huán)節(jié)中的主要設(shè)備，可直接接觸牛乳頭和生奶，采奶罩杯中的細(xì)菌總數(shù)和類型可直接影響生奶的質(zhì)量和牛體的健康，這一研究結(jié)果提示我們保持采奶設(shè)備的清潔是嚴(yán)格把控原奶質(zhì)量關(guān)的必要條件；進一步分析發(fā)現(xiàn)，牛乳頭消毒前C1樣品中OTU數(shù)目為2 267個，而牛乳頭消毒后C2樣品中的OTU數(shù)目為2 218，這一結(jié)果顯示，荷斯坦奶牛擠奶前的乳頭藥浴至關(guān)重要，奶牛榨乳前乳頭的清潔度對生奶質(zhì)量的影響也同樣不可忽視。

表1 樣品間測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

不同取樣點細(xì)菌群落OTU韋恩圖如圖1所示，4個樣本中共同含有的OTU為1377個，其中C1獨有145個OUT，C2獨有126個OTU，E獨有268個OUT，M 1獨有259個OTU，分別占總各自O(shè)UT總數(shù)的6.39%，5.68%，10.7%，和12.7%。以上結(jié)果表明擠奶環(huán)節(jié)不同取樣點的細(xì)菌組成存在一定差異，但擠奶環(huán)節(jié)4個取樣點中的細(xì)菌物種大部分是一致的，說明這些細(xì)菌物種是同一環(huán)境中的優(yōu)勢菌種，是影響生鮮乳質(zhì)量的關(guān)鍵微生物。另外，結(jié)果還顯示擠奶環(huán)節(jié)的4個不同取樣點中E取樣點（采奶罩杯）中獨有微生物種類最多，是影響生鮮乳質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

2.2 各樣點細(xì)菌群落alpha多樣性分析

以多樣性指數(shù)Sobs（observed species：表征實際觀測到的物種數(shù)目）做稀釋曲線圖，結(jié)果如圖2所示，結(jié)果如圖2所示，4個取樣點24個樣本的稀釋曲線基本趨于平緩狀態(tài)，說明所得序列基本可反映真實不同取樣點的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，再增大數(shù)據(jù)量對OTU的發(fā)現(xiàn)也沒有影響，樣本的OTU覆蓋度已基本飽和，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更大的測序量不會引起物種多樣性的顯著增長，基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)量的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖1 不同取樣點細(xì)菌群落OTUs的維恩分析

圖2 不同取樣點細(xì)菌群落測序的稀釋曲線

Alpha多樣性指數(shù)分析是指對單個樣品中物種多樣性的分析，可以反映微生物群落中物種數(shù)量，通過一系列指數(shù)分析來估計微生物的物種豐富度(Chao1、Ace指數(shù))和 多樣性(Shannon、Simpson指數(shù))，而Coverage指數(shù)代表覆蓋度。Shannon、Simpson指數(shù)越大，則表示該樣品中的物種越豐富，反之則物種多樣性越低。各樣品中的Alpha多樣性指標(biāo)如表2所示，由表2綜合分析可知，不同樣本的Alpha多樣性指數(shù)如表2所示，不同取樣點細(xì)菌類群Alpha多樣性統(tǒng)計中的Chao指數(shù)、Ace指數(shù)差異顯著（p＜0.05），各取樣點的Chao指數(shù)在1018.7～1510.2；Shannon指數(shù)在4.827～5.779；Simpson指數(shù)在0.008～0.041；儲奶罐奶M 1中的Shannon指數(shù)在4個取樣點中最高，而Simpson指數(shù)明顯低于其它3個取樣點，這一結(jié)果說明儲奶罐奶的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均勻度最好；牛乳頭消毒前C1的Chao指數(shù)在4個取樣點中最高，說明牛乳頭消毒前的細(xì)菌菌群多樣性高于其他組；綜合分析發(fā)現(xiàn)采奶罩杯E中的Shannon指數(shù)與Chao指數(shù)都較高，說明采奶罩杯的細(xì)菌群落具有較高多樣性。

2.3 擠奶環(huán)節(jié)各樣點細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分析

基于OTU的物種分類分析，在相似性為97%水平上，4個取樣點的24個樣本中的細(xì)菌種類共注釋到33個門，76個綱，122個目，214個科，420個屬和202個種。由圖3可見，在門分類水平上，擠奶環(huán)節(jié)的4個取樣點的優(yōu)勢菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、軟壁菌門（Tenericutes）和梭桿菌門（Fusobacteria）。其中，各樣點細(xì)菌相對豐度最高的菌門為厚壁菌門（Firmicutes），分別是C1占31.5%，C2占44.8%，E占44.7%，M 1占41.1%，其次為擬桿菌門（Bacteroidetes），在擠奶環(huán)節(jié)的各樣點所占含量分別為C1 28.7%，C2 24.3%，E 21.3%，M 1 29.5%；再次為變形菌門（Proteobacteria）其在擠奶環(huán)節(jié)各樣點的含量分別為C1 21.2%，C2 15.9%，E 17.4%，M 1占15.5%；另外，儲奶罐奶（M 1）樣本中螺旋菌門（Spirochaetae）占比為1.75%、軟壁菌門（Tenericutes）的含量為2.45%，均高于其他3個取樣點。

圖3 樣本中細(xì)菌在門分類水平的比較

表2 樣品間Alpha多樣性統(tǒng)計

進一步分析發(fā)現(xiàn)（圖4），24個樣本在屬水平上已注釋到的物種豐度Top18菌屬，分別是不動桿菌屬（Acinetobacter）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、丁 酸 弧 菌 屬（Butyrivibrio）、金 黃 桿 菌 屬（Chryseobacterium）、糞球菌屬（Coprococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、黃氏諾爾氏菌（Knoellia）、考克氏菌屬（Kocuria）、球菌屬（Macrococcus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、反芻桿菌屬（Ruminobacter）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、密螺旋體屬（Treponema）。各樣點含量最多的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬（Acinetobacter），分 別 是C1占13.52%，C2占6.23%，E占5.84%，M 1占5.03%，其在4個樣點中的平均含量為7.67%；其次是節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter），分別在C1中占細(xì)菌總數(shù)的7.71%，C2中占細(xì)菌總數(shù)的4.00%，在取樣點E中占細(xì)菌總數(shù)的3.66%，M 1中占0.86%，其在4個樣點中的平均含量為4.06%；在細(xì)菌屬分類水平上，相對含量第三的是鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），分別是C1占2.76%，C2占1.02%，E占0.50%，M 1占0.17%，其在4個樣點中的平均含量為1.11%；擠奶環(huán)節(jié)4個不同取樣點，細(xì)菌菌群在屬水平分類上存在菌群豐度差異性：不動桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、鞘氨醇桿菌屬和巨型球菌屬這四類優(yōu)勢菌屬在擠奶環(huán)節(jié)的牛乳頭消毒前（C1）的含量均高于其他3個取樣點；進一步分析發(fā)現(xiàn)采奶罩杯（E）中金黃桿菌屬（Chryseobacterium）含量為2.71%，棒狀桿菌屬（Corynebacterium）含量為2.36%，Chryseobacterium和Corynebacterium在奶牛養(yǎng)殖場采奶全鏈條各取樣點的采奶罩杯E中的含量均高于其他3個取樣點；牛乳頭消毒后（C2）中水棲菌屬（Enhydrobacter）含量為2.45%，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）含量為1.72%，Enhydrobacter與Psychrobacter在牛乳頭消毒后C2中的含量均高于其他3個取樣點；而普氏菌屬（Prevotella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、密螺旋體屬（Treponema）在儲奶罐奶（M 1）中的含量分別為1.85%、1.92%、1.68%，均高于其他3個取樣點。

圖4 屬分類水平不同取樣點細(xì)菌群落的多樣性

2.4 不同取樣點細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

從屬水平各取樣點細(xì)菌群落Top18菌屬做熱圖（圖5），熱圖中共顯示擠奶不同環(huán)節(jié)與儲奶罐奶中18個細(xì)菌菌屬，分別是不動桿菌屬（Acinetobacter）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、糞球菌屬（Coprococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、黃氏諾爾氏菌（Knoellia）、考克氏菌屬（Kocuria）、球菌屬（Macrococcus）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、反芻桿菌屬（Ruminobacter）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、密螺旋體屬（Treponema）。從圖中可以看出，擠奶環(huán)節(jié)的4個取樣點屬水平存在差異性，牛乳頭消毒前（C1）細(xì)菌群落豐富度最高，牛乳頭消毒后（C2）與采奶罩杯（E）中的細(xì)菌相對豐度基本持平，儲奶罐奶（M 1）細(xì)菌相對豐度最低，推測與擠奶前的消毒及采奶設(shè)備的消毒有必然聯(lián)系。牛奶中的微生物主要來自奶牛體內(nèi)以及擠奶、貯運、運輸?shù)冗^程中的污染，生牛乳中的微生物中細(xì)菌的數(shù)量最多，奶牛發(fā)生乳房炎時牛奶中會出現(xiàn)大量的金黃色葡萄球菌、鏈球菌及化膿桿菌等致病菌，乳頭消毒過程可以避免乳頭上的致病菌進入到原奶中，采奶罩杯可以直接接觸牛乳頭，采奶罩杯的清潔度也可以直接影響原奶的品質(zhì)[12-14，16-18]。本研究中注釋到的優(yōu)勢菌門有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）等；優(yōu)勢菌屬有不動桿菌屬（Acinetobacter）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、節(jié)細(xì)菌（Arthrobacter）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等，這一研究結(jié)果與前人研究結(jié)果部分一致[19-22]；優(yōu)勢菌屬中有一些是致病菌如不動桿菌屬和球菌屬，不動桿菌屬是人類的條件致病菌，當(dāng)機體抵抗力降低時容易引起機體感染，球菌屬特別是金黃色葡萄球菌是泌乳牛乳腺炎的主要致病菌且易受環(huán)境影響，研究表明：乳頭、牛舍、擠奶設(shè)備等都是金黃色葡萄求均可能的污染源[23-25]。Oliveria等研究發(fā)現(xiàn)泌乳牛乳頭擠奶前的清洗程度直接影響生鮮乳中金黃色葡萄球菌的含量[26-27]；采奶罩杯中的細(xì)菌含量可以直接影響儲奶罐中生鮮乳的質(zhì)量，因此采奶罩杯的消毒與滅菌環(huán)節(jié)對生鮮乳的質(zhì)量控制同樣十分關(guān)鍵。防治生鮮乳微生物污染的最好方法是控制或去除每種有害微生物的來源，但由于奶牛養(yǎng)殖場特別的生產(chǎn)方式，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)非常困難[3,28-29]。因此，及時、準(zhǔn)確進行微生物趨勢分析以達(dá)到預(yù)警效果，以及建立安全生產(chǎn)規(guī)程，是防患于未然的高效手段。

圖5 屬分類水平不同取樣點細(xì)菌豐度熱圖

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，奶牛養(yǎng)殖場擠奶環(huán)節(jié)中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，優(yōu)勢菌屬有不動桿菌屬、弓形桿菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、丁酸弧菌屬等，采奶環(huán)節(jié)不同取樣點的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性與豐富度差異較大，梭菌屬（Clostridium），丁酸弧菌屬（Butyrivibrio），和水棲菌屬（Enhydrobacter），在乳頭消毒前（C1）與乳頭消毒后（C2）相對含量差異極為顯著（P＜0.05），說明擠奶前的乳頭消毒環(huán)節(jié)至關(guān)重要，alpha-多樣性分析發(fā)現(xiàn)采奶罩杯E中的Shannon指數(shù)與Chao指數(shù)都較高，說明采奶罩杯的細(xì)菌群落具有較高多樣性；因此采奶罩杯的消毒與滅菌環(huán)節(jié)對生鮮乳的質(zhì)量控制同樣十分關(guān)鍵。