王永芳，婁婷婷，溫華蔚，周磊

（1.天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300457；2.天津海關(guān) 工業(yè)產(chǎn)品安全技術(shù)中心，天津300457）

0 引 言

氟蟲(chóng)腈是一種苯基吡唑類農(nóng)藥[1，2]。氟蟲(chóng)腈經(jīng)水解及光解作用，生成氟蟲(chóng)腈亞砜、氟蟲(chóng)腈砜、氟甲腈[3]，相關(guān)部門對(duì)氟蟲(chóng)腈及代謝物的毒性及對(duì)環(huán)境友好度進(jìn)行了評(píng)估[4-5]，氟蟲(chóng)腈代謝產(chǎn)物的毒性比母體大很多[6]，使用不當(dāng)會(huì)損害肝臟、腎臟等，我國(guó)于2009年10月1日起禁用氟蟲(chóng)腈，歐盟一些國(guó)家也要求禁止使用氟蟲(chóng)腈進(jìn)行防蟲(chóng)[7-8]。

我國(guó)禁止在用于食品加工的動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中使用氟蟲(chóng)腈。國(guó)際上，牛奶中氟蟲(chóng)腈最大殘留限量要求如下：《日本肯定列表》為0.02 mg/kg；歐盟(EU)No750/2010為0.005 mg/kg。國(guó)內(nèi)GB 2763-2019中明確了氟蟲(chóng)腈在生乳中的限量[9]，該限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)氟蟲(chóng)腈檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中未指定生乳的檢測(cè)方法[10-13]，且目前我國(guó)未制定乳制品中氟蟲(chóng)腈殘留量檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。目前檢測(cè)氟蟲(chóng)腈的文獻(xiàn)[14-20]越來(lái)越多，其中檢測(cè)方法涉及到動(dòng)物源性食品的基質(zhì)大部分為雞蛋和禽肉類，牛奶基質(zhì)較少。本文采用乙腈提取，PEP Plus萃取柱進(jìn)行凈化，能快速準(zhǔn)確地測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及代謝物的含量。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料和儀器

乳制品：牛奶、奶粉（市售）；氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜、氟蟲(chóng)腈亞砜，純度＞98.0%，德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司；乙腈、正己烷、丙酮，色譜純級(jí)，迪馬科技；乙酸銨(＞98.0%)，氯化鈉（＞99.5%）；國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（色譜純）、Cleanert PEP Plus（60 mg/3 m L），博納艾杰爾；Florisil固相萃取柱(1 g/6 mL)，色譜科；C18固相萃取柱（150 mg/3 mL），博納艾杰爾。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，安捷倫1290-6460；AL204-IC型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Promax-2020型水平往復(fù)振蕩器，德國(guó)Heidolph公司；XH-D型渦旋混合器，上海汗諾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20℃冰箱進(jìn)行保存。根據(jù)檢測(cè)需要，用乙腈逐級(jí)稀釋至所需濃度。

工作液的配制。選擇空白牛奶基質(zhì)，取適量氟蟲(chóng)腈及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一系列濃度的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

流動(dòng)相配制。10 mmol乙酸銨-0.1%甲酸-水溶液：稱取乙酸銨0.78 g，溶解于1 L高純水中，再加入1 mL甲酸，搖勻，常溫保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2色譜條件

色譜柱：Eclipse C18，100 mm×2.1 mm，1.7μm；流速為0.3 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μL；流動(dòng)相為流動(dòng)相A：0.1%甲酸乙腈；流動(dòng)相B：10 mmol乙酸銨和0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，10%A；1～7 min，100%A；7～8 min，10%A。

1.2.3質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源，負(fù)離子模式掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；電噴霧電壓：4 000 V；霧化氣壓力：40 psi；離子源溫度：350℃；其他參數(shù)如表1所示。

表1 氟蟲(chóng)腈及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4樣品前處理

1.2.4.1樣品提取

取5 g牛奶(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中，加入含1%甲酸乙腈10 mL，加入2 g的NaCl，渦旋混勻后，進(jìn)行超聲提取10 min，轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心5 min，上清液待凈化。

1.2.4.2樣品凈化

取上述待凈化提取液2 mL，加入到PEP Plus萃取柱中，前0.5 mL流出液棄去，收集剩余的上樣流出液。過(guò)0.22μm過(guò)濾膜，上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)牛奶基質(zhì)中主要成分為水，還含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖及礦物質(zhì)等，其中的蛋白質(zhì)、脂肪和一些維生素會(huì)干擾目標(biāo)物的提取。關(guān)于動(dòng)物源性食品中氟蟲(chóng)腈殘留量的測(cè)定的文獻(xiàn)[21-22]中提取試劑均選擇了乙腈，由于丙酮和乙酸乙酯在提取目標(biāo)物的同時(shí)，會(huì)萃取出含量較高的脂肪，不利于下一步凈化處理，而乙腈在提取過(guò)程中，加入1%甲酸能很好的沉淀蛋白[23]，減少脂肪和其他雜質(zhì)的溶出，能減少基質(zhì)對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物的干擾，加入適量NaCl鹽析后更好地進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)采用含1%甲酸的乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方法的選擇和優(yōu)化

牛奶中含有蛋白質(zhì)和脂肪等成分，經(jīng)過(guò)乙腈提取后，通過(guò)過(guò)凈化，能更好的去除雜質(zhì)的干擾，同時(shí)減少提取液中雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)儀器的污染。本研究中選擇Cleanert PEP Plus固相萃取柱，F(xiàn)lorisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB凈化柱，氨基石墨復(fù)合柱4種凈化柱進(jìn)行試驗(yàn)比較。本研究中Florisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB凈化柱，氨基石墨復(fù)合柱需進(jìn)行活化和洗脫，Cleanert PEP Plus固相萃取柱直接對(duì)提取液進(jìn)行凈化。從目標(biāo)物的回收率實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)凈化所需時(shí)間綜合分析，氨基石墨復(fù)合柱和Cleanert PEP Plus固相萃取柱回收率相當(dāng)，回收率在80%以上，氨基石墨復(fù)合柱需要活化洗脫，所需時(shí)間是Cleanert PEP Plus固相萃取柱凈化時(shí)間的5倍時(shí)間，F(xiàn)lorisil固相萃取柱、Waters Oasis PRiME HLB凈化柱回收率偏低，綜上最終選擇Cleanert PEP Plus凈化柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4種凈化柱的回收率如圖1所示。

圖1 不同凈化柱對(duì)氟蟲(chóng)腈及其代謝物回收率的影響

2.3 液相和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氟蟲(chóng)腈及其代謝物的極性為弱極性，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[24-27]，比較C8和C18色譜柱，如圖2所示，從目標(biāo)物分離程度及峰形比較，Eclipse C18色譜柱對(duì)目標(biāo)物的分離效果和峰形較好，最終選擇Eclipse C18色譜柱，考慮到樣品基質(zhì)中雜質(zhì)的干擾，為使目標(biāo)化合物獲得較好的分離和峰形，降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾，對(duì)下列幾種流動(dòng)相進(jìn)行比較：A:0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）；B：乙腈-水；C：甲醇-水，如圖3所示，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行考察，甲醇-水（C），目標(biāo)物分離程度不如乙腈-水(B)、0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）(C)兩種流動(dòng)相，通過(guò)相應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行比較，0.1%甲酸乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）（A）使目標(biāo)物相應(yīng)強(qiáng)度更好，最終選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相。

圖2 氟蟲(chóng)腈色譜

圖3 3種不同流動(dòng)相氟蟲(chóng)腈的色譜

氟蟲(chóng)腈及代謝物的分子結(jié)構(gòu)中有較多的氟、氯等鹵代基，在電離過(guò)程中，分子中易失去氫質(zhì)子，形成負(fù)離子，所以本方法在電噴霧離子源（ESI）下采用負(fù)離子模式進(jìn)行掃描。選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行分析。首先對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析，確定出4種目標(biāo)物的母離子，在MS2 SIM掃描模式下優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓（Fragmentor）參數(shù)，按照優(yōu)化出的參數(shù)進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，通過(guò)Product Ion掃描模式進(jìn)行分析，選取信號(hào)最強(qiáng)的兩個(gè)子離子，通過(guò)MRM掃描模式進(jìn)一步優(yōu)化，確定為各自的定量參數(shù)，見(jiàn)表1。按上述優(yōu)化的前處理參數(shù)和儀器參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖4～5。

圖4 空白牛奶樣品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜

圖5 空白基質(zhì)中添加1μg/kg水平4種化合物的MRM色譜

3 方法驗(yàn)證

3.1 基質(zhì)效應(yīng)的考察

在選用質(zhì)譜進(jìn)行樣品分析時(shí)，會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect,M E）問(wèn)題。空白基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率相比，比值越接近1，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)越不明顯，通常采用同一樣品的空白基質(zhì)配制曲線進(jìn)行校正定量，或者選用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法等方法減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾[28]。本方法選擇空白牛奶基質(zhì)，用該空白基質(zhì)溶液和純?cè)噭┘状挤謩e配制一定梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率比值如表2，通過(guò)表2，可以看出，氟蟲(chóng)腈、氟甲腈、氟蟲(chóng)腈砜和氟蟲(chóng)腈亞砜在牛奶基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)可以接受，基質(zhì)效應(yīng)不是很明顯，本實(shí)驗(yàn)為降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，選用相應(yīng)的空白基質(zhì)配制曲線，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

表2 氟蟲(chóng)腈及其3種代謝物在牛奶基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng) %

3.2 方法的線性及靈敏度

在空白牛奶基質(zhì)中，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1，2，5，10，20，50μg/kg梯度水平制作基質(zhì)曲線，氟蟲(chóng)腈及代謝物曲線的線性關(guān)系良好，R2均大于0.99，各化合物的定量離子的信噪比均大于10，氟蟲(chóng)腈及代謝物的定量限為1μg/kg，以3倍信噪比確定為定性限，氟蟲(chóng)腈及代謝物的定性限為0.6μg/kg，線性方程、相關(guān)系數(shù)R2等參數(shù)見(jiàn)表3。

3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在空白牛奶樣品，分別添加1，2，5μg/kg 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行6平行實(shí)驗(yàn)，氟蟲(chóng)腈及代謝物的回收率為82.5%～97.4%，變異系數(shù)4.0%～10.5%范圍內(nèi)，見(jiàn)表4。其結(jié)果符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的相關(guān)要求。

3.4 實(shí)際樣品分析

從超市購(gòu)買20批次牛奶樣品，按照優(yōu)化的檢測(cè)方法進(jìn)行樣品處理檢測(cè)，該20批次牛奶樣品中均未檢測(cè)出氟蟲(chóng)腈及3種代謝物。

表3 氟蟲(chóng)腈及代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限數(shù)據(jù)

表4 方法的平均回收率和精密度（n=6） %

4 結(jié) 論

本研究?jī)?yōu)化了樣品前處理萃取試劑參數(shù)，選擇酸化乙腈進(jìn)行提取，優(yōu)化了凈化參數(shù)，選擇Cleanert PEP Plus固相萃取柱進(jìn)行凈化，優(yōu)化了色譜及質(zhì)譜參數(shù)，建立了LC-MS/MS法測(cè)定牛奶中氟蟲(chóng)腈及其三種代謝物的測(cè)定方法。該方法的回收率、精密度、線性、測(cè)定低限等均滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求，適用于牛奶中氟蟲(chóng)腈及代謝物的快速檢測(cè)。該研究方法優(yōu)點(diǎn)：定量限低于國(guó)內(nèi)外牛奶中氟蟲(chóng)腈限量值，完全滿足限量檢測(cè)需求，其次，該方法檢測(cè)效率高，酸性乙腈提取效率高，凈化柱無(wú)需活化，優(yōu)化后的儀器條件等因素大大縮短了檢測(cè)目標(biāo)物的時(shí)間，便于對(duì)大批量牛奶中氟蟲(chóng)腈進(jìn)行快速篩查。國(guó)家強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019中規(guī)定了生乳的限量，但沒(méi)有相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，該方法的建立可以為建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)參考，同時(shí)也可以為相關(guān)執(zhí)法部門提供技術(shù)支撐，從而保障進(jìn)出口乳制品的質(zhì)量。