任麗芳，馬玉珍，何金英

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科；2.婦產(chǎn)科醫(yī)學(xué)生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)指妊娠期間發(fā)生糖耐量異常，是妊娠期常見的并發(fā)癥之一[1]。隨著現(xiàn)代亞健康生活方式、肥胖人口增多以及孕婦平均生育年齡的上升，近年來GDM發(fā)病率逐漸上升。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示2015年全球妊娠期血糖增高患者為16.2%，其中GDM患者高達(dá)85.0%[2]。妊娠期血糖增高若未經(jīng)及時(shí)有效治療可對(duì)孕婦生命健康、胎兒發(fā)育以及胎兒結(jié)局產(chǎn)生嚴(yán)重不良影響[3]。有研究發(fā)現(xiàn)孕婦胎盤組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporters，GLUT)、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(insulin receptor substrates，IRS)、性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)水平表達(dá)與GDM緊密相關(guān)，其對(duì)GDM的發(fā)病程度和預(yù)后情況都具有明顯判定價(jià)值[4]。因此，本研究主要通過對(duì)GDM孕婦胎盤組織中的GLUT、IRS、SHBG水平表達(dá)進(jìn)行分析，探討這些指標(biāo)表達(dá)水平及與GDM發(fā)病的關(guān)系。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2017年12月至2018年12月期間在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科定期產(chǎn)檢并且行剖宮產(chǎn)的GDM孕婦42例作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合GDM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并經(jīng)臨床確診；②既往無糖尿病史或其他慢性病史；③妊娠37～42周，有剖宮產(chǎn)手術(shù)指征；④無其他妊娠期并發(fā)癥；⑤按時(shí)產(chǎn)檢且病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有糖尿病史或其他慢性病史；②有胎兒畸形、流產(chǎn)、死胎分娩史；③合并心、肺、肝、腎等重要器官功能損害者。另選取同一時(shí)期行剖宮產(chǎn)的健康孕婦42例作為對(duì)照組，對(duì)照組各項(xiàng)產(chǎn)檢指標(biāo)正常，排除標(biāo)準(zhǔn)同研究組。所有研究對(duì)象由本院檢驗(yàn)科檢測(cè)空腹血糖、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)2h血糖、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游離甲狀腺素4(free thyroxine 4，F(xiàn)T4)。本次研究已獲得所有研究對(duì)象知情同意，且經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究標(biāo)本

當(dāng)產(chǎn)婦分娩胎盤隨之娩出時(shí)迅速在臍帶附著處剪取3塊1cm3的絨毛組織，采用生理鹽水洗凈并作吸干處理，于凍存管中經(jīng)液氮速凍4h，再保存在-80℃條件下備用。

1.3研究試劑

qPCR檢測(cè)中所需要的RNA引物、Trizol試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)PCR試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。Western blot檢測(cè)中所需要的鼠抗人GLUT-1單克隆抗體、兔抗人GLUT-3單克隆抗體、兔抗人GLUT-4單克隆抗體，兔抗人IRS-1單克隆抗體、兔抗人IRS-2單克隆抗體、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，P13K)p85α單克隆抗體，SHBG單克隆抗體均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司。

1.4研究方法

1.4.1 qPCR檢測(cè)

提取凍存已裂解的GDM胎盤組織和健康孕婦胎盤組織各100mg，采用Trizol試劑提取胎盤組織總RNA，測(cè)定濃度、純度合格后將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再通過實(shí)時(shí)定量PCR儀(型號(hào)ABI 7300)擴(kuò)增。反應(yīng)體系30μL，反應(yīng)條件：于95℃下持續(xù)10min，預(yù)變性，再于95℃下持續(xù)15s變性；60℃退火且延伸45s，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，然后采用2(-△△CT)法對(duì)目的基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算處理。

1.4.2 Western blot檢測(cè)

提取妊娠合并糖尿病胎盤組織和健康孕婦胎盤組織，加入蛋白裂解液并充分裂解(4℃條件下，12 000r/min，離心10min)，收集上清總蛋白，測(cè)定蛋白濃度、純度合格，分別取40μL上樣量進(jìn)行電泳(SDS-PAGE凝膠)，轉(zhuǎn)印(75V、90min)，封閉(10%脫脂奶粉)1h，滴加鼠抗人GLUT-1單克隆抗體(1∶200)、兔抗人GLUT-3多克隆抗體(1∶200)、兔抗人GLUT-4單克隆抗體(1∶200)、兔抗人IRS-1單克隆抗體(1∶200)、IRS-2單克隆抗體(1∶200)、兔抗人PI3K-p85α單克隆抗體(1∶500)、兔抗人SHBG單克隆抗體(1∶200)，采用兔源性β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參照，4℃孵育過夜。洗膜，分別與對(duì)應(yīng)的二抗于室溫下孵育2h，并ECL顯色，采用自動(dòng)凝膠成像分析儀(購(gòu)自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，SG2011)分析各條帶灰度值。所有檢測(cè)操作均有專人負(fù)責(zé)，且嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1兩組孕婦一般資料比較

研究組空腹血糖、OGTT 2h血糖、新生兒體重均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，兩組其他一般資料相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組孕婦一般資料比較

2.2兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG mRNA表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，研究組孕婦胎盤組織中GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85α、SHBG mRNA水平表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，而研究組孕婦胎盤組織中IRS-1、GLUT-1 mRNA水平表達(dá)較對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表2。

表2 兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG mRNA表達(dá)比較

2.3兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組相比，研究組孕婦胎盤組織中GLUT-3、GLUT-4、IRS-1、SHBG蛋白水平表達(dá)顯著降低(均P<0.05)，而研究組孕婦胎盤組織中P13K-p85α、IRS-2、GLUT-1蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3，兩組孕婦的蛋白電泳條見圖1。

表3 兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG蛋白表達(dá)比較

注：1～5正常對(duì)照組，6～10GDM組。

2.4兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG mRNA水平表達(dá)相關(guān)性分析

經(jīng)過Pearson分析結(jié)果顯示：SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85αmRNA水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r值分別為2.081、4.842、3.660、3.492，均P<0.05)；IRS-2與GLUT-1、GLUT-4 mRNA水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r值分別為4.033、2.841，均P<0.05)；IRS-1與GLUT-3、P13K-p85αmRNA水平表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性(r值分別為-5.124、-3.556，均P<0.05)。

2.5兩組孕婦胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG蛋白水平表達(dá)相關(guān)性分析

經(jīng)過Pearson分析結(jié)果顯示：SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2蛋白水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r值分別為4.337、2.734、4.625，均P<0.05)；IRS-2與GLUT-1、GLUT-4蛋白水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r值分別為4.851、4.508，均P<0.05)；IRS-1與GLUT-3蛋白水平表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-4.667，P<0.05)。

3討論

3.1妊娠糖尿病發(fā)病機(jī)制

探尋GDM的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)行早期診斷以及進(jìn)行針對(duì)性的預(yù)防和治療對(duì)保護(hù)母嬰健康至關(guān)重要[6]。目前臨床研究普遍認(rèn)為GDM發(fā)病機(jī)制主要與胰島素抵抗相關(guān)，而胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常改變能夠直接引發(fā)胰島素抵抗。當(dāng)體內(nèi)胰島素結(jié)合α亞基受體后，誘發(fā)β亞基絡(luò)氨酸殘基自身磷酸化，并使IRS-1、IRS-2絡(luò)氨酸殘基磷酸化，從而與下游效應(yīng)分子調(diào)節(jié)單位P13K-p85α相結(jié)合，激活下游效應(yīng)因子P13K調(diào)節(jié)GLUT，GLUT失調(diào)可影響機(jī)體糖代謝平衡，由此可見胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生異常改變都可直接影響胰島素的生物效應(yīng)[7]。

3.2胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG的作用

GLUT是一類葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，作為載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)單糖來維持機(jī)體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)，也是孕婦與胎兒之間葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白，是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的最終步驟。研究報(bào)道孕婦胎盤組織中主要存在GLUT-1、GLUT-3、GLUT-4[8]。其中GLUT-1的含量最多而且分布較廣，其負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)母體循環(huán)和胎盤之間的葡萄糖，是孕婦與胎兒之間葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的最主要的分子。GLUT-3的含量較少且呈散在分布，負(fù)責(zé)將葡萄糖從胎盤血池轉(zhuǎn)運(yùn)至臍靜脈。GLUT-4的含量雖然最少，但卻在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵性作用，該分子負(fù)責(zé)胎盤絨毛中的葡萄糖代謝，而胰島素可促使其加快轉(zhuǎn)運(yùn)速率，當(dāng)GLUT-4表達(dá)降低則胰島素敏感性隨之下降，進(jìn)而發(fā)生胰島素抵抗[9-10]。因此，胎盤中GLUT表達(dá)異?？赡芘c葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)異常以及胰島素抵抗息息相關(guān)。此次研究結(jié)果也證實(shí)研究組孕婦胎盤組織中GLUT-3、GLUT-4 mRNA以及蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組而言均顯著降低(P<0.05)，說明GDM與孕婦胎盤組織中GLUT的表達(dá)水平具有一定的相關(guān)性。

IRS在胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要作用是作為胰島素受體和P13K-p85α相連接的遞質(zhì)，當(dāng)IRS與胰島素受體結(jié)合能力下降時(shí)，胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到影響，從而引發(fā)胰島素抵抗。此次研究結(jié)果顯示，研究組孕婦胎盤組織中IRS-1蛋白較對(duì)照組而言顯著降低(P<0.05)，呈低表達(dá)。與王麗娜等[11]的研究結(jié)果相符，證實(shí)孕婦胎盤組織中IRS-1的含量與GDM具有明顯相關(guān)性。

SHBG是由肝臟產(chǎn)生的一種運(yùn)輸性激素的載體蛋白，調(diào)控人體內(nèi)性激素水平，可隨著胰島素水平的上升而下降，與胰島素抵抗密切相關(guān)，在GDM孕婦血清中呈低表達(dá)，故而也可將其用來預(yù)測(cè)GDM的發(fā)生和進(jìn)展[12]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)GDM孕婦的胎盤組織中也有SHBG表達(dá)存在[13]。本次研究結(jié)果顯示，研究組孕婦胎盤組織中SHBG mRNA以及蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組而言均有顯著降低(P<0.05)，提示GDM孕婦胎盤組織中SHBG水平表達(dá)明顯下調(diào)。

3.3胎盤組織中GLUT、IRS、SHBG的相關(guān)性

本次研究Pearson分析結(jié)果顯示，SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2、P13K-p85αmRNA水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，IRS-2與GLUT-1、GLUT-4 mRNA水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，IRS-1與GLUT-3、P13K-p85αmRNA水平表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。另外，SHBG與GLUT-3、GLUT-4、IRS-2蛋白水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，IRS-2與GLUT-1、GLUT-4蛋白水平表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，IRS-1與GLUT-3蛋白水平表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，以上結(jié)果提示GLUT-4 mRNA以及蛋白水平降低與胰島素抵抗的程度具有相關(guān)性，且IRS-2在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮較大的作用。此次研究與以往研究結(jié)果相符[14]。

綜上所述，GDM患者的GLUT、IRS、SHBG mRNA及蛋白水平表達(dá)顯著降低，且三者之間具有相關(guān)性。