郝廣煜，方 剛，代玉晶，李 娟，侯瑞麗，賈建新，楊占君，霍東升

(包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

人參屬植物具有重大的藥用價值，人參(Panax ginseng Meyer)和三七(P. notoginseng (Burk) F. H. Chen)都是人參屬植物中的藥材。人參皂苷Rb1是從人參提取出的最豐富的生物活性形式，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物活性[1]。研究證實，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與機體的氧化產(chǎn)物水平增加有著密切的關(guān)系。腦內(nèi)含有大量的脂質(zhì)且耗氧量較高，活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄積引起的損傷可能是疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[2]。因此，延緩神經(jīng)退行性疾病的有效治療方法之一可能就是通過抗氧化劑清除過量的ROS。H2O2屬于活性氧自由基，為主要的ROS之一，是引起氧化應(yīng)激的一個中介物。PC12細胞來源于褐家鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，在體外培養(yǎng)時與神經(jīng)元生長特征相似，廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)細胞的功能、分化和死亡領(lǐng)域。趙立理等研究發(fā)現(xiàn)H2O2可引起PC12細胞氧化應(yīng)激損傷，細胞活力下降[3]。帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，致病過程復雜，氧化應(yīng)激是其眾多致病因素之一。本實驗采用H2O2構(gòu)建PC12細胞損傷模型，通過檢測細胞活性，探討人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞損傷模型的影響，為人參皂苷在PD方面的治療研究提供理論參考依據(jù)，同時也為中藥材資源的開發(fā)與利用積累資料。

1 材料與方法

1.1實驗材料 PC12大鼠嗜鉻瘤細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。人參皂苷Rb1購自上海同田生物技術(shù)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清為美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RNAiso plus、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 均購自TaKaRa大連公司；引物HO-1和GCLC由生工生物工程(上海)有限公司合成；DMSO和青霉素、鏈霉素購自海克隆生物化學制品(北京)有限公司)；噻唑藍(MTT)購自sigma公司；30 %過氧化氫(H2O2)購自天津富宇試劑有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1PC12細胞培養(yǎng) PC12細胞用含5 %胎牛血清、5 %馬血清、100 mg/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖的影響 細胞按1×105個/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2條件下孵育12 h后，分別加入系列濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL) 的人參皂苷Rb1。同時設(shè)空白對照組(未加人參皂苷Rb1)，每組設(shè)置3個平行孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)。根據(jù)公式：細胞存活率=[(藥物孔OD值-本底對照孔OD值) /(對照細胞孔OD值-本底對照孔OD值)]×100 %計算細胞存活率。

1.2.3人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用 取對數(shù)期PC12 細胞，濃度調(diào)整為1×105個/mL并接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2條件下孵育12 h后，棄去原培養(yǎng)液，將PC12細胞分為對照組、模型組和實驗組。實驗組加入系列濃度的人參皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)溶液，模型組和對照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，終體積為100 μL/孔，預處理12 h。待處理結(jié)束后，模型組和實驗組直接加入H2O2溶液，終濃度為400 μmol/L，對照組加入等體積DMEM完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置5個平行孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)并計算細胞存活率。

1.2.4HO-1和GCLC基因的轉(zhuǎn)錄水平分析 按上述方法培養(yǎng)細胞，1 000 r/min離心10 min收集細胞，重懸于1 mL RNAiso plus中提取總RNA。以0.5 μg RNA為模板按 PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴增引物：HO-1 forward (5'-GCCTGCTAGCCTGGTTCAAG-3') 和HO-1 reverse (5'-AGCGGTGTCTGGGATGAACTA-3')[4]；GCLC forward (5'-GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3') 和GCLC reverse (5'-TGTTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3') ；GAPDH forward (5'-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3') 和GAPDH reverse (5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3') ，反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ反應(yīng)液配制說明配制。檢測樣品做3個重復，且至少3次獨立重復實驗。擴增程序為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析通過待測基因與內(nèi)參基因Ct值的差值來計算基因表達差異，即基因表達水平變化倍數(shù)= 2-[(干預后待測基因-干預后參照基因)-(干預前待測基因-干預前參照基因)]。

2 結(jié)果

2.1人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖的影響 采用MTT法檢測人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，與空白組比較，人參皂苷Rb1系列濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)對PC12細胞的增殖作用無顯著性差異(P>0.05)。實驗結(jié)果表明，在實驗濃度范圍內(nèi)人參皂苷Rb1對細胞增殖無影響，無細胞毒性作用(圖1)。

2.2人參皂苷Rb1對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的影響 MTT法檢測細胞存活率如圖2所示，與正常對照組比較，模型組顯著地降低PC12細胞存活率(P<0.001)；與模型組比較，實驗組不同濃度人參皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)培養(yǎng)24 h后細胞的存活率升高，且呈劑量依賴性增高，0.2 mg/mL和0.4 mg/mL組細胞存活率顯著性增高(P<0.001)。

圖1 人參皂苷Rb1對PC12細胞增殖的影響

圖2 人參皂苷Rb1對PC12細胞存活率的影響

2.3人參皂苷Rb1對PC12細胞的HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用qRT-PCR方法，檢測人參皂苷Rb1對PC12細胞HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，人參皂苷Rb1(0.4 mg/mL)組的HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.001，圖3A)，而對照組的HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05，圖3A)；人參皂苷Rb1(0.4 mg/mL)組的GCLC基因轉(zhuǎn)錄水平與模型組、對照組均無顯著性差異(P>0.05，圖3B)。

圖3 人參皂苷Rb1對PC12細胞的HO-1

3 討論

目前，針對PD不同病因已在體外建立了多種細胞模型，例如氧化應(yīng)激損傷模型、缺糖缺氧模型等，它們具有周期短、條件易控、便于重復等優(yōu)點。PC12細胞有神經(jīng)內(nèi)分泌細胞特征，且易存活、可傳代、增殖快，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選及機制研究中[5]。大量研究表明，自由基損傷是造成PD的重要原因之一，其中ROS與PD發(fā)病有著密切的關(guān)系。ROS生成過多而體內(nèi)活性酶的清除能力下降，使得機體處于氧化應(yīng)激環(huán)境之中[6,7]。H2O2作為氧化損傷的誘導劑，化學性質(zhì)活躍，易于出入細胞，引起細胞毒性而導致細胞死亡。細胞毒性檢測主要根據(jù)細胞膜通透性的變化。常用的檢測方法有MTT、CCK8和LDH等，用于檢測細胞存活率。實時無標記細胞分析技術(shù)(RealTime Cellular Analysis，RTCA)是近幾年出現(xiàn)的新技術(shù)手段，可以實時、動態(tài)、定量跟蹤細胞形態(tài)和增殖分化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組的細胞存活率顯著低于正常對照組，提示H2O2誘導細胞損傷模型成功建立。實驗組細胞存活率高于模型組，呈劑量依賴性增高，劑量達到0.2 mg/mL出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，表明人參皂苷Rb1能夠降低PC12細胞中H2O2誘導的細胞損傷。目前大量的研究證據(jù)表明，ROS不但有信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控細胞活性生理功能，還可參與介導多種炎癥介質(zhì)的生物學活性作用及直接或間接損傷細胞的結(jié)構(gòu)[8]。H2O2暴露可增加細胞內(nèi)ROS或直接參與氧化應(yīng)激，誘導自由基產(chǎn)生，導致細胞損傷。人參皂苷Rb1可能是通過其抗氧化活性減少自由基產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激，從而對細胞起到保護作用。

血紅素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血紅素分解代謝過程中的限速酶。HO有三種類型：氧應(yīng)激誘導型HO-1、組成型HO-2及尚未明確的HO-3。HO -1本身及其代謝產(chǎn)物均有抗氧化損傷的功能，臨床上以HO-1的表達量作為組織氧化應(yīng)激水平的重要參考。研究證實，HO-1基因的上調(diào)對細胞氧化損傷具有保護作用[9]。本研究結(jié)果顯示人參皂苷Rb1能夠上調(diào)細胞內(nèi)HO-1基因表達，提示人參皂苷Rb1可能通過上調(diào)HO-1基因表達發(fā)揮對H2O2誘導細胞損傷的保護作用，其上調(diào)機制還需進一步驗證。

綜上所述，人參皂苷Rb1能夠?qū)笻2O2誘導的細胞損傷，提高細胞存活率，起到保護作用。人參皂苷Rb1可能是通過上調(diào)HO-1基因表達，增加抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激損傷而完成，具體機制還需進一步設(shè)計實驗驗證。