張 艷，彭永帥

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.鄭州市獸醫(yī)生物制品技術(shù)重點實驗室，河南 鄭州 450046)

蜱是吸食血液為生的節(jié)肢動物，可吸食多種脊椎動物包括人類的血液，其作為傳播媒介的能力僅次于蚊子[1]。蜱可傳播多種病原，包括細菌、病毒和原蟲等，其中一些病原具有人獸共患特點，給畜牧業(yè)造成重大損失，并影響人類健康。目前在中國境內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的蜱共有10個屬，117個種，其中包含13個軟蜱種，超過100個硬蜱種[2]。

無形體屬于立克次氏體目(Rickettsiales)，無形體科(Anaplasmataceae)，無形體屬(Anaplasma)，該屬的成員包括嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophilum)、綿羊無形體(A.ovis)、牛無形體(A.bovis)、邊緣無形體(A.marginale)、扁平無形體(A.platys)、中央無形體(A.centrale)和新發(fā)現(xiàn)的山羊無形體(A.capra)。其中嗜吞噬細胞無形體和山羊無形體具有人獸共患特點，其它無形體種則具有不同的宿主傾向，主要感染動物的血細胞，引起無形體病。該病的主要臨床癥狀為發(fā)熱、貧血、黃疸、流產(chǎn)、衰弱、消瘦等，急性發(fā)病時可使動物死亡。蜱是無形體病的主要傳播媒介。我們采集了河南省部分地區(qū)寄生于山羊、綿羊等動物體表的蜱，首先對其進行種類鑒定，然后使用巢式PCR方法擴增蜱體內(nèi)的嗜吞噬細胞無形體、綿羊無形體、牛無形體和邊緣無形體，并對得到的基因序列進行種系發(fā)育分析，以期為該地區(qū)無形體病的防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2011年7月～2012年9月分別自河南洛陽、三門峽、商丘、南陽、平頂山、鄭州、安陽、駐馬店等14個地市30個采樣點共采集蜱蟲樣品355只，混池法提取DNA共計100份。2016年5月8日自許昌市襄城縣某肉牛場采集蜱蟲56只，其中32只鏡檢觀察，其余24只混池法提取DNA 5份。合計DNA樣本共105份。所采集的硬蜱均來自動物體表，其中綿羊體表73份，山羊體表12份，牛體表11份，犬體表3份，刺猬體表6份。

1.2 主要試劑

動物組織基因組DNA提取試劑盒，源自康為世紀公司；rTaq DNA 聚合酶、LA Taq DNA聚合酶，源自Takara公司；75%乙醇、10% KOH溶液、瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑等。

1.3 硬蜱樣品的鏡檢

前處理：將4 ℃保存的硬蜱置于10% KOH溶液中，在酒精燈火焰上加熱，根據(jù)蟲體大小確定加熱消化時間，至蟲體透明為止。

鏡檢：將消化透明后的蟲體置于潔凈載玻片上，滴加甘油水，蓋上蓋玻片，于顯微鏡下觀察，重點觀察部位為假頭基、眼、口器、緣垛、氣門板、尾突等。

1.4 PCR

硬蜱組織DNA的提取參照試劑盒說明書進行。硬蜱種類鑒定所用的靶基因為硬蜱的16S rDNA基因和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer，ITS-2)基因。檢測硬蜱攜帶的無形體病原所用的靶基因與具體引物序列見表1。

PCR反應(yīng)體系為：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。擴增硬蜱ITS-2基因及巢式PCR的第一輪反應(yīng)中，使用LA Taq DNA聚合酶代替rTaq DNA聚合酶，PCR緩沖液也使用該酶對應(yīng)的緩沖液，其余相同。

巢式PCR反應(yīng)，第一輪反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；第二輪反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。擴增硬蜱16S rDNA的反應(yīng)條件同上述第二輪反應(yīng)條件，擴增硬蜱ITS-2基因的反應(yīng)條件同上述第一輪反應(yīng)條件。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測及序列分析

使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR所得產(chǎn)物，將陽性產(chǎn)物送交測序公司進行雙向測序，其中硬蜱ITS-2基因的每個樣品均進行3次測序反應(yīng)，以便拼接后獲得完整的基因序列。

使用NCBI的BLAST工具在線比對，找出與目標序列高度同源的序列，同時從GenBank數(shù)據(jù)庫下載不同地區(qū)、不同宿主來源的相應(yīng)基因序列，用Mega X 10.0.5軟件，在Kimura 2-parameter模型下進行種系發(fā)育分析，并采用最大似然法(ML法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，Bootstrap進行1000次重復(fù)檢驗。

表1 本實驗所用引物

2 結(jié)果

2.1 硬蜱種類鑒定結(jié)果

對2016年采集自某肉牛場肉牛體表的32只硬蜱進行消化透明后，顯微鏡下觀察其形態(tài)特征，結(jié)果見圖1。由圖可知，該蜱肛側(cè)板長，副肛側(cè)板稍短，氣門板呈長圓形，無緣垛，假頭基呈六邊形，齒式4/4，每縱列8枚齒，尾突呈三角形。綜合上述形態(tài)特征可初步判定其可能為微小牛蜱(B.microplus)。

A、B：雄性微小牛蜱整體圖；C：微小牛蜱假頭基部位；D：雄性微小牛蜱腹部及尾突。標尺=50 μm。圖1 微小牛蜱形態(tài)

以硬蜱組織基因組DNA為模板，擴增其16S rDNA基因和ITS-2基因部分序列，擴增得到了與預(yù)期大小一致的目的條帶(圖2)，將陽性產(chǎn)物全部送交公司測序，對105份硬蜱樣品的測序結(jié)果進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)本文擴增得到的基因序列與微小牛蜱(16份)、長角血蜱(83份)、褐黃血蜱(6份)的相應(yīng)基因序列同源性>98%，不同蜱種的宿主來源見表2。根據(jù)16S rDNA和ITS-2基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹也顯示本文所得序列與上述三種硬蜱的對應(yīng)序列遺傳差異非常小。

由上述形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)種類鑒定結(jié)果推測，本研究采集的硬蜱樣品分屬于微小牛蜱(16份)、長角血蜱(83份)、褐黃血蜱(6份)三個蜱種。

M：DNA標準DL 2000；1～10：硬蜱樣品16S rDNA 基因(A)和ITS-2基因(B)擴增結(jié)果。圖2 硬蜱16S rDNA和ITS-2基因PCR結(jié)果

表2 不同硬蜱種類的宿主來源

2.2 硬蜱體內(nèi)無形體感染情況

對105份硬蜱基因組DNA樣本，使用表1中引物對擴增4種無形體(嗜吞噬細胞無形體、牛無形體、綿羊無形體和邊緣無形體)的部分基因序列，PCR擴增結(jié)果如圖3～圖5所示，上述引物均擴增得到了與預(yù)期大小一致的目的條帶。

M：DNA標準DL 2000；1～8：蜱組織DNA樣品；9：陽性對照；10：陰性對照。圖3 硬蜱樣品嗜吞噬細胞無形體16S rRNA擴增結(jié)果

M：DNA標準DL 2000；1～9：蜱組織DNA樣品；10：陽性對照；11：陰性對照。圖4 硬蜱樣品綿羊無形體和邊緣無形體msp4擴增結(jié)果

M：DNA標準DL 2000；1～19：蜱組織DNA樣品；20：陰性對照；21：陽性對照圖5 硬蜱樣品牛無形體16S rRNA擴增結(jié)

105份硬蜱樣品感染無形體的整體情況見表3。由表可知，83份長角血蜱均有無形體感染，其中綿羊無形體的陽性率最高，為26.5%；1份長角血蜱樣本檢測到了人獸共患病原——嗜吞噬細胞無形體；另外還有1份長角血蜱樣本中檢測到綿羊無形體和牛無形體的混合感染。微小牛蜱樣本中只檢測到邊緣無形體，未發(fā)現(xiàn)其他種類的無形體。褐黃血蜱樣本中上述4種無形體均為陰性。總體而言，本調(diào)查所采集的蜱蟲樣品中，綿羊無形體的感染率最高，為20.9%(22/105)，其次為邊緣無形體(5.7%，6/105)，1份長角血蜱樣本檢測到嗜吞噬細胞無形體這一人獸共患病原。

表3 三種硬蜱的無形體感染情況

2.3 4種無形體的種系發(fā)育分析

將上述PCR擴增得到的陽性樣品全部送交測序公司進行測序，再對測序結(jié)果進行比對，找出有差異序列，最終共得到嗜吞噬細胞無形體序列1條(19-1)；牛無形體序列2種(b2和b02-1)，二者僅有1個堿基的差異；綿羊無形體序列2種(11和22)，二者相差2個堿基；邊緣無形體序列2種(p54和p66)，二者只有1個堿基存在差異。將上述得到的序列結(jié)合GenBank下載的其他序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖6和圖7所示，嗜吞噬細胞無形體和牛無形體基于16S rRNA基因構(gòu)建進化樹，綿羊無形體和邊緣無形體基于msp4基因構(gòu)建進化樹。由圖可知，本研究得到的序列均與已知的相應(yīng)該無形體種的序列位于同一進化分支上。

使用Mega X 10.0.5軟件中Kimura two-parameter模型，構(gòu)建的最大似然法進化樹?！鸫肀狙芯康玫降氖韧淌杉毎麩o形體序列；□代表本研究得到的牛無形體序列。圖6 基于16S rRNA基因的嗜吞噬細胞無形體(A. phagocytophilum)和牛無形體(A. bovis)進化樹

使用Mega X 10.0.5軟件中Kimura two-parameter模型，構(gòu)建的最大似然法進化樹?！翊肀狙芯康玫降倪吘墴o形體序列；■代表本研究得到的綿羊無形體序列。圖7 基于msp4基因的綿羊無形體(A. ovis)和邊緣無形體(A. marginale)進化樹

3 討論

本調(diào)查采集自動物體表的蜱蟲樣本中，長角血蜱占比最高，為79.0%(83/105)，其次為微小牛蜱(15.2%，16/105)，還有6份采集自刺猬和犬體表的褐黃血蜱(5.7%)。105份蜱蟲樣品中，83份長角血蜱均有無形體感染，其中綿羊無形體占比26.5%，僅有1份(0.9%)樣品為嗜吞噬細胞無形體陽性，該病原為人獸共患病原；微小牛蜱樣本中只檢測到邊緣無形體；褐黃血蜱樣本中上述4種無形體均為陰性。整體上，本調(diào)查所采集的蜱蟲樣品中，綿羊無形體的感染率最高，為20.9%(22/105)，其次為邊緣無形體(5.7%，6/105)，1份長角血蜱樣本種檢測到嗜吞噬細胞無形體這一人獸共患病原。

長角血蜱一般在氣候溫暖地區(qū)分布較多，如美國的多個州、加拿大、日本、韓國及中國的大部分地區(qū)[9-13]。2012年，陳卓等[14]自河南信陽10個村莊的家畜體表采集蜱蟲308只，鑒定后發(fā)現(xiàn)96.75%為長角血蜱，其余為微小牛蜱。這一結(jié)果與本調(diào)查所得結(jié)果整體一致。

2000年，曹務(wù)春等在黑龍江的森林牧場采集到372只全溝硬蜱，并在該批硬蜱體內(nèi)檢測到粒細胞埃立克體[15]，這是全世界首次在全溝硬蜱體內(nèi)檢測到病原。之后我國學(xué)者在多個省份不同種類的硬蜱體內(nèi)檢測到多種血液中寄生的病原，包括立克次氏體、梨形蟲、螺旋體等[16]。有研究表明，美國加利福尼亞地區(qū)的太平洋硬蜱體內(nèi)嗜吞噬細胞無形體的感染率為0.8%[17]，這一結(jié)果與本調(diào)查得到的嗜吞噬細胞無形體陽性率非常接近。曹務(wù)春等[18]在黑龍江和內(nèi)蒙地區(qū)采集的全溝硬蜱中檢測到的嗜吞噬細胞無形體陽性率高達4.6%(62/1 345)，分析發(fā)現(xiàn)其采樣地區(qū)為高山森林區(qū)，植被異常茂盛，為硬蜱的繁殖及病原傳播提供了良好條件。Anifowose OI等的研究發(fā)現(xiàn)，采集自牛體表的彩飾璃眼蜱體內(nèi)的反芻獸埃利希體感染率顯著高于牛血液中該病原的感染率[19]。在中國東北的哈爾濱市一項關(guān)于蜱蟲種類及其攜帶病原的調(diào)查中，作者發(fā)現(xiàn)長角血蜱是動物體表的優(yōu)勢蜱種，而采集自植被上的蜱蟲中，全溝硬蜱則是優(yōu)勢蜱種。該研究鑒定出的5種蜱中，檢測到2種人獸共患的立克次氏體：雷氏立克次氏體(Rickettsiaraoultii)和新塔拉塞維奇立克次體(CandidatusRickettsiatarasevichiae)，且來自動物體表的蜱蟲的病原感染率顯著高于采自植被的蜱(40.7% vs 19.5%)[20]。由此推測動物在人獸共患蜱傳疾病的傳播過程中發(fā)揮著重要作用。