趙婷，史穎，劉東來，陳永勤

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

白接骨(Asystasiellaneesiana(Wall.) Lindau)為爵床科白接骨屬植物，是我國重要的傳統(tǒng)中藥材之一，其干燥的根莖及葉具有化瘀止血、續(xù)筋接骨、利尿消腫、清熱解毒等功效，主治吐血、便血、外傷出血、跌打損傷、腹水水腫、咽喉腫痛、瘡癰腫毒等癥[1].白接骨在我國分布較廣，有多種別稱，如接骨丹、接骨草、玉接骨、玉龍盤、血見愁、麒麟草、玉連環(huán)、金不換等[1].

研究表明，白接骨有顯著的抑菌作用.李芝芳等[2]發(fā)現(xiàn)，白接骨水提取液對普通化膿及創(chuàng)傷感染中常見的細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、八疊球菌、破傷風(fēng)桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌、大腸桿菌等)都有抑制作用，尤其是對金黃色葡萄球菌最為敏感.張森等[3]比較了白接骨水提液和醇提液對大腸桿菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)醇提液的效果顯著好于水提液.張森等[4]還發(fā)現(xiàn)白接骨醇提物對標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株和對甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、頭孢曲松、環(huán)丙沙星等藥物具有多重耐藥性的豬源大腸桿菌菌株都有較好的抑菌效果.

目前，白接骨可以通過種子進(jìn)行繁殖.但是，白接骨結(jié)實(shí)率較低、種子數(shù)量少，每果只有4粒種子，而且遺傳雜合的品種(植株)不宜用種子繁殖.此外，白接骨也可以通過分株方法進(jìn)行無性繁殖，但速度較慢.植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下培養(yǎng)各種植物材料使其長出人們所需要的細(xì)胞、組織、器官或植株.植物組織培養(yǎng)的植株再生技術(shù)可以用于快速、高效繁殖植物，所生產(chǎn)的組培苗健壯、整齊，為規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化栽培創(chuàng)造了條件.人們還可以根據(jù)需要利用植物組培技術(shù)去除原植物體內(nèi)的病原菌和病毒(即脫毒培養(yǎng))，脫毒組培苗的應(yīng)用可以大大降低病害發(fā)生的危險(xiǎn)，從而更好地保持優(yōu)良品種的原有特性.植物組培苗生產(chǎn)技術(shù)在一些農(nóng)作物、果樹、花卉和經(jīng)濟(jì)林業(yè)樹種上得到了廣泛應(yīng)用，并取得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益.中藥材是中醫(yī)中藥的基礎(chǔ)，藥用植物組培技術(shù)也一直受到人們的高度重視，很多重要中藥材的組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)獲得了成功并用于組培苗生產(chǎn)，如人參[5-6]、山藥[7]、地黃[8]、枸杞[9-10]、甘草[11]、丹參[12]、鐵皮石斛[13]、白芨[14]、金線蓮[15]等.

迄今，白接骨組織培養(yǎng)在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊上少見報(bào)道.因此，本文報(bào)道植物激素對白接骨芽誘導(dǎo)、增殖和生根的影響，以及組培苗移栽技術(shù).本研究結(jié)果將為白接骨組培苗生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 植物材料白接骨采于江西省九江市，種于溫室內(nèi)花盆中，常規(guī)護(hù)養(yǎng).

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件本試驗(yàn)所用的基本培養(yǎng)基為添加20 g/L的蔗糖和7 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基[16].初代莖段培養(yǎng)基含0.5 mg/L 6-芐基氨基嘌呤(BA)，芽增殖培養(yǎng)基含0.5 mg/L BA和不同濃度赤霉素(GA3).在不同細(xì)胞分裂素對芽增殖影響的試驗(yàn)中，所用的細(xì)胞分裂素為BA，激動(dòng)素(KT)和噻苯隆(TDZ)，濃度見表1.不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L萘乙酸(NAA)和不同濃度BA或TDZ(表2).生根培養(yǎng)基添加不同濃度吲哚丁酸(IBA)(表3).所有培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8，121 ℃消毒15 min.

培養(yǎng)室溫度為(25 ± 1) ℃，培養(yǎng)架的光照強(qiáng)度為30～40 μmol m-2s-1，光周期為光照16 h/黑暗8 h.

1.3 外植體消毒與培養(yǎng)取生長健壯的白接骨莖，剪去葉片，用自來水和家用洗滌劑(雕牌)小心清洗后，將莖剪成帶節(jié)的小段(3 ～ 4 cm長)，在含1%有效氯的次氯酸鈉溶液中消毒15 min.然后，用無菌水漂洗3次，再切除兩端，將帶節(jié)的莖段(0.5 ～ 0.7 cm長)接種到初代莖段培養(yǎng)基上.

1.4 芽增殖培養(yǎng)在合適的芽增殖培養(yǎng)基上，芽每30 d繼代增殖1次.繼代時(shí)，將幼莖切成帶芽的小段，再接到新鮮的增殖培養(yǎng)基上.

1.5 不同細(xì)胞分裂素對芽增殖的影響為了獲得更好的芽(幼莖)增殖培養(yǎng)基配方，將增殖培養(yǎng)基上形成的幼莖切成帶芽的小段，接到含不同種類和不同濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上.30 d后，根據(jù)幼莖數(shù)、芽增殖效率和幼莖生長情況，確定適合芽增殖的細(xì)胞分裂素種類和濃度.

1.6 不定芽誘導(dǎo)將增殖培養(yǎng)基上幼莖的葉片切成約0.5 cm長的小塊，接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)時(shí)間為50 d.不定芽形成后，再轉(zhuǎn)到芽增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖.

1.7 植株再生與組培苗移栽將增殖培養(yǎng)基上形成的幼莖切成2～3 cm長，接種到不同的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根.組培苗生根后，將其取出，用自來水洗去附著的培養(yǎng)基，在溫室栽入由泥炭土、蛭石和珍珠巖(7∶2∶1)配制的基質(zhì)中(容器為穴盤)，澆透水.以后根據(jù)需要澆水，每7 d噴灑2次MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽營養(yǎng)液.溫室的溫度為24～28 ℃，相對濕度為60%～80%，自然光，光強(qiáng)大約為自然光照的2/3.生長30 d后，將溫室的組培苗移栽到室外的試驗(yàn)地中.

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞分裂素對芽增殖的影響、不定芽誘導(dǎo)和生根等處理試驗(yàn)均重復(fù)3次，每個(gè)處理每次重復(fù)接種4或6瓶、每瓶10個(gè)材料.用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，處理間的差異顯著性分析采用Duncan新復(fù)極差法.

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段培養(yǎng)與芽增殖莖段接種到初代莖段培養(yǎng)基上3 d后開始出現(xiàn)污染，14 d后污染率為70%(32/46).接種后5 d，部分莖段上的側(cè)芽開始膨大、變綠，隨后伸長.在培養(yǎng)的46個(gè)莖段中，有38個(gè)(包括污染的莖段)發(fā)生了側(cè)芽的生長，側(cè)芽發(fā)生率達(dá)82.6%，35 d后沒有污染的莖段產(chǎn)生1或2個(gè)伸長的新幼莖(圖1A).

圖1 白接骨離體植株再生與繁殖A.初代培養(yǎng)基上莖段形成的幼莖；B.在含0.5 mg/L BA和0.3 mg/L GA3培養(yǎng)基上形成的纖細(xì)幼莖；C. 在含0.5 mg/L BA和0.05 mg/L GA3培養(yǎng)基上一個(gè)莖段形成的健康幼莖；D.在含1 mg/L BA和0.05 mg/L GA3培養(yǎng)基上的一個(gè)莖段所形成的叢生幼莖，生長正常；E. 在含1 mg/L TDZ和0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上葉片分化的不定芽(箭頭所指)；F. 在含1 mg/L IBA培養(yǎng)基上生根良好的再生植株

表1 細(xì)胞分裂素對白接骨幼莖增殖的影響

將新幼莖切成帶節(jié)的小段、接種到新鮮初代莖段培養(yǎng)基上，14 d后除帶頂芽的莖段外，帶側(cè)芽的莖段都沒有明顯生長.將其轉(zhuǎn)到含0.3 mg/L赤霉素(GA3)和0.5 mg/L BA的培養(yǎng)基上，5 d后所有莖段上的芽生長明顯. 隨后，顯著伸長，30 d后形成的幼莖纖細(xì)、節(jié)數(shù)少(圖1B).為了探索適合的赤霉素濃度，將幼莖切成帶頂芽或側(cè)芽的小段、分別接種到含0.02、0.05、0.10、0.15和0.20 mg/L GA3培養(yǎng)基上.在30 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，所有莖段上的芽都能有效伸長，其中0.10、0.15和0.20 mg/L GA3培養(yǎng)基上的幼莖伸長顯著，但纖細(xì)、節(jié)數(shù)少.在0.02和0.05 mg/L GA3培養(yǎng)基上的幼莖較粗壯，生長正常(圖1C).隨后，芽的增殖在含0.5 mg/L BA和0.05 mg/L GA3的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行，每30 d增殖一次.

2.2 不同細(xì)胞分裂素對幼莖增殖的影響由表1可知，細(xì)胞分裂素的種類及濃度對白接骨的芽增殖有較大影響.總地來說，芽(幼莖)數(shù)量和增殖系數(shù)都隨細(xì)胞分裂素濃度的增加而增加.在所試驗(yàn)的3種細(xì)胞分裂素中，激動(dòng)素(KT)的效果最差，平均幼莖數(shù)/莖段和增殖系數(shù)在2 mg/L時(shí)最高，分別為1.9和3.5，均顯著低于BA和TDZ處理的相應(yīng)指標(biāo).TDZ促進(jìn)幼莖增殖的效果最好，0.2、0.5和1 mg/L三個(gè)處理的平均幼莖數(shù)/莖段分別為3.6、3.9和4.2，幾乎都顯著高于BA和KT的各個(gè)處理.但在TDZ培養(yǎng)基上，幼莖伸長和葉片伸展受到了顯著抑制，與1 mg/L和2 mg/L BA處理相比，其繁殖系數(shù)并沒有優(yōu)勢；另外，在0.5和1 mg/L TDZ培養(yǎng)基上幼莖還出現(xiàn)明顯的玻璃化現(xiàn)象.相比之下，BA最適合白接骨的幼莖增殖，效果與濃度有關(guān).在BA濃度為2 mg/L時(shí)，平均芽數(shù)和增殖效率最高，分別為3.2和6.4，但部分幼莖也有玻璃化現(xiàn)象；而在1 mg/L時(shí)，增殖效果比較好，平均幼莖數(shù)/莖段和增殖效率分別為2.6和5.9，幼莖較粗、葉片伸展，無玻璃化現(xiàn)象(圖1D).

2.3 不定芽的誘導(dǎo)與增殖在各種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，10 d后部分葉塊的傷口處出現(xiàn)愈傷組織，至21 d時(shí)愈傷組織產(chǎn)生率達(dá)到100%.在50 d的誘導(dǎo)期間，所有BA培養(yǎng)基上的葉塊都沒有形成不定芽，愈傷組織大都變褐，甚至死亡；4種TDZ培養(yǎng)基都有少數(shù)葉塊分化了不定芽(圖1E).其中，以1 mg/L TDZ的誘導(dǎo)率最高，為24.2%(表2).在TDZ誘導(dǎo)培養(yǎng)基上不定芽幾乎不伸長，轉(zhuǎn)到含1 mg/L BA和0.05 mg/L GA3的芽增殖培養(yǎng)基上后，它們都能正常伸長并增殖.

表2 BA和TDZ對白接骨葉片外植體分化不定芽的影響

2.4 芽生根與組培苗移栽將增殖培養(yǎng)基上所形成的幼莖接種到含不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基上，7～10 d后基部開始出現(xiàn)根，20 d后生根率達(dá)到100%.雖然，在無激素培養(yǎng)基上白接骨幼莖能100%生根，但添加IBA可以促進(jìn)早生根、多生根(表3，圖1F).在2 mg/L IBA培養(yǎng)基上，再生植株的根數(shù)最多，但基部的愈傷組織也比較大.因此，IBA濃度以1或1.5 mg/L為宜.

表3 IBA對白接骨幼莖生根的影響

2019年3月上旬，在溫室進(jìn)行組培苗移栽試驗(yàn)，共移栽8個(gè)穴盤，共256株.移栽7 d后，組培苗生長明顯，莖伸長、葉變大；30 d后組培苗成活率為96.5%(247/256)，生長健壯，部分組培苗形成了叢生苗(圖2A).將這些馴化的組培苗移栽到室外試驗(yàn)地后，成活率達(dá)到100%，植株生長良好，并在5月下旬開花(圖2B).

3 討論

莖段培養(yǎng)是植物組培苗生產(chǎn)的首選方法.它不僅操作簡單，而且組培苗變異的幾率最小.在進(jìn)行莖段培養(yǎng)時(shí)，芽的萌動(dòng)生長率及其隨后的伸長、生長情況對繁殖效率有決定性的影響.植物激素在這兩方面具有重要調(diào)節(jié)作用，通過篩選激素種類和濃度可以得到最佳的芽增殖培養(yǎng)基.

圖2 白接骨組培苗移栽A. 溫室中移栽30 d后的組培苗，生長良好；B.移栽到試驗(yàn)地60 d后的馴化組培苗，生長旺盛并開花

自然條件下，白接骨基部的芽能萌動(dòng)生長和伸長，進(jìn)一步生根.我們發(fā)現(xiàn)，在離體條件下，白接骨莖段上的芽在含0.5 mg/L BA的培養(yǎng)基上不能有效伸長，因而嚴(yán)重影響芽的增殖效率.但是，在培養(yǎng)基中添加低濃度(0.02～0.05 mg/L)赤霉素GA3能有效地解決這個(gè)問題.

細(xì)胞分裂素具有誘導(dǎo)芽分化和促進(jìn)芽增殖的作用.傳統(tǒng)的細(xì)胞分裂素都是嘌呤衍生物，如天然的玉米素(zeatin，ZT)和N6-異戊烯基腺嘌呤(2iP)、及人工合成的激動(dòng)素(KT)和N6-芐基氨基嘌呤(BA).噻苯隆(TDZ)是上世紀(jì)末人工合成的苯基脲衍生物，為棉花脫葉劑.后來發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)烈的細(xì)胞分裂素活性，甚至超過傳統(tǒng)的細(xì)胞分裂素[17-18]，已成為植物組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素之一.同一植物對不同的細(xì)胞分裂素往往反應(yīng)不一樣，如Ellis等比較了BA、ZT和TDZ誘導(dǎo)白云杉不定芽的效果，發(fā)現(xiàn)ZT最好[19]；Joo等在進(jìn)行栝樓的莖段培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)KT促進(jìn)芽增殖的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于ZT、2iP、BA和TDZ[20].在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TDZ促進(jìn)白接骨莖段形成新幼莖的能力顯著高于KT和BA，但對幼莖的生長有負(fù)作用(抑制幼莖伸長、葉片伸展，并導(dǎo)致玻璃化.因此，TDZ并不適合白接骨芽的增殖.TDZ抑制芽生長的負(fù)作用在米糕果[21]、白鶴芋[22]和香蕉[23]等植物上也有報(bào)道.從芽的增殖效率和生長情況來看，BA更適合白接骨，在含1 mg/L BA和0.05 mg/L GA3的培養(yǎng)基上，1個(gè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d可以增殖5.9倍(表1)，而且，不定芽生長正常、后期能正常生根.按此繁殖效率，理論上,用1個(gè)白接骨芽1年就可以生產(chǎn)2億多株組培苗.

建立白接骨的不定芽誘導(dǎo)技術(shù)不僅可以用于快速繁殖，還可以用于培育轉(zhuǎn)基因植株，對于今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對其進(jìn)行遺傳改良有重要意義.盡管BA可以有效地促進(jìn)白接骨芽的增殖，但在試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)(1～5 mg/L)并沒有誘導(dǎo)葉片外植體形成不定芽，而0.5～2 mg/L TDZ可以，最佳濃度為1 mg/L，誘導(dǎo)率為24%.生根關(guān)系到組培苗的質(zhì)量.生長素常用來誘導(dǎo)、促進(jìn)生根.雖然，白接骨的幼莖在無激素培養(yǎng)基上也能有效生根，但添加1或1.5 mg/L IBA能顯著改善生根效果.再生的組培苗根多、且較粗壯，有利于組培苗移栽后的成活和生長.

總之，本研究成功建立了以莖段和葉片為外植體的白接骨離體再生與快速繁殖技術(shù)，為白接骨的組培苗生產(chǎn)和基因工程研究提供了參考.