張振洋

(英格爾檢測技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司， 上海 201109)

0 引言

氟吡菌胺(fluopicolide)，化學(xué)名稱為 2,6-二氯-N-[(3-氯-5-三氟甲基-2-吡啶基)甲基]苯甲酰胺(結(jié)構(gòu)式見圖1[1])，是由德國拜耳作物科學(xué)公司開發(fā)的苯甲酰胺類殺菌劑，該產(chǎn)品具有優(yōu)良的系統(tǒng)傳導(dǎo)性和較強的薄層穿透力，對病原菌各主要形態(tài)均有較好的抑制作用，能夠為新葉、莖干、塊莖、幼果提供全面和持久保護(hù)，主要應(yīng)用于葡萄和蔬菜種植中，對霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等常見卵菌綱病害具有良好防效，而對作物和環(huán)境則相對安全[2-5].

圖1 氟吡菌胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前，氟吡菌胺已在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果和糧作物的疾病防治[6]. 植物源性食品中氟吡菌胺的殘留檢測方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]，前處理一般采用的是農(nóng)產(chǎn)品檢測快速樣品前處理技術(shù)(簡稱QuEChERS)[10]，固相萃取[11]、液液萃取[12]和分散固相萃取[6-8]，后兩種前處理法屬于傳統(tǒng)前處理方法，費時且消耗大量的有機試劑；QuEChERS[13]前處理法雖在時間上比傳統(tǒng)的固相萃取、液-液萃取和分散固相萃取[14]有優(yōu)勢，有機試劑消耗少，但是QuEChERS法是在非密閉條件下進(jìn)行，且萃取液無法濃縮處理；使用QuEChERS 前處理法對植物性樣品中的色素是無法去除的，大濃度的色素對后續(xù)質(zhì)譜分析會產(chǎn)生一定的影響. 同時，在前處理過程中需要加入凝膠滲透色譜(GPC)粉，GPC粉用量對目標(biāo)物質(zhì)的影響目前尚未有詳細(xì)的研究。另外，對于含水量低或者脂肪含量高的樣品，凈化效果不理想，提取效率低、凈化過程損失大.

本研究建立了一種以乙腈為萃取劑，在密閉條件下采用加壓溶劑萃取，結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性食品中氟吡菌胺殘留量的分析方法。該方法具有前處理簡單、萃取率高、檢出限低、準(zhǔn)確度和精密度高等優(yōu)點.

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑Agilent 1290 Infinity Ⅱ/6460 Triple Quad LC-MS/MS高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配AJS ESI離子源；電子天平(Sartorius，BT25S)：德國賽多利斯公司，感量為0.1 mg；快速萃取儀：E-916型(BUCHI Labortechnik AG)；渦旋混合器：QL-866，其林貝爾(海門)；氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：農(nóng)殘級，CAS：239110-15-7，100.3 mg/L；氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液Ⅰ：10.03 μg/mL，稱取氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.00 mL于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液Ⅱ：1.00 μg/mL，移取1.00 mL儲備液Ⅰ于10.0 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；乙腈：農(nóng)殘級；甲醇：農(nóng)殘級.

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱：C18 2.1×100 mm×3.5 μm； 柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A(5 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液)，B(甲醇)梯度洗脫.梯度洗脫條件見表1.

表1 梯度脫洗程序

1.2.2 質(zhì)譜條件 離子源溫度：350 ℃；電噴霧電壓：4.0 kV；干燥氣：氮氣；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；保留時間、定性及定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量及保留時間見表 2.

表2 質(zhì)譜采集參數(shù)

1.2.3 快速溶劑萃取儀條件 加熱溫度100 ℃，載氣壓力100 psi，靜態(tài)萃取5 min，萃取池淋洗體積為60%池體積，氮氣吹掃時間60 s，循環(huán)靜態(tài)萃取次數(shù)為2次.

1.3 試驗方法準(zhǔn)確稱取約5 g植物源性粉碎樣品，與一定量的無水硫酸鈉充分混勻、脫水，反復(fù)研磨成細(xì)小顆粒，全部轉(zhuǎn)移至萃取池中，以乙腈為萃取劑進(jìn)行快速溶劑萃取。萃取液經(jīng)自動濃縮儀濃縮至約0.5 mL，用萃取溶劑準(zhǔn)確定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后轉(zhuǎn)移到自動進(jìn)樣小瓶中，按上述儀器條件進(jìn)行測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析按上述色譜條件，待儀器穩(wěn)定后連續(xù)注入氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，直至連續(xù)兩次進(jìn)樣儀器響應(yīng)保留時間相對變化小于1%。其色譜和質(zhì)譜分別見圖2與圖3. 可見，氟吡菌胺保留時間為5.12 min，響應(yīng)值最大的子離子質(zhì)荷比為172.9，次級響應(yīng)離子質(zhì)荷比為364.9.

圖2 氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖

1-索氏提取；2-超聲提??；3-加壓溶劑萃取圖4 不同提取方法對氟吡菌胺回收率的影響

2.2 萃取條件的選擇

2.2.1 不同提取方法的比較 對比了索氏提取、超聲提取和加壓溶劑萃取3種不同提取方法的回收率，見圖4. 可以看出，加壓溶劑萃取法回收率明顯高于索氏提取和超聲提取法. 在整個萃取過程中，加壓溶劑萃取儀器始終處在密閉的高溫、高壓下進(jìn)行，而高溫和高壓有助于提高氟吡菌胺在溶劑中的溶解度，顯著提高了萃取效率. 其次，在密封的條件下減少了揮發(fā)損失，從而也有助于提高萃取效率.

2.2.2 萃取溶劑的選擇 萃取溶劑的選擇對目標(biāo)化合物的提取影響非常大。分別選擇甲醇、乙腈、正己烷、丙酮、正己烷-二氯甲烷(1∶1)和丙酮-二氯甲烷(1∶2)為提取溶劑，固定加熱溫度120 ℃，載氣壓力120 psi，靜態(tài)萃取15 min，萃取池淋洗體積70%池體積，氮氣吹掃時間90 s，循環(huán)靜態(tài)萃取次數(shù)2次，按照色譜條件進(jìn)行檢測，考察萃取溶劑對氟吡菌胺回收率的影響，結(jié)果見圖5.

由圖5知，在相同實驗條件下，乙腈的回收率最高，達(dá)到了95%～98%，明顯優(yōu)于其他萃取溶劑，因此本試驗選擇乙腈作為萃取溶劑.

1-正己烷；2-甲醇；3-乙腈；4-丙酮；5-正己烷-二氯甲烷；6-丙酮-二氯甲烷圖5 萃取劑對氟吡菌胺回收率的影響

2.2.3 萃取溶劑的用量 萃取劑乙腈的用量是影響試驗結(jié)果的重要因素之一，試驗對比了乙腈用量分別為5、10、15、20、25、30 mL時對氟吡菌胺回收率的影響，結(jié)果見圖6.

圖6 萃取溶劑的用量對氟吡菌胺回收率的影響

由圖6知，隨著乙腈用量的不斷增加，目標(biāo)化合物氟吡菌胺的回收率先逐漸升高，后逐漸趨于平衡，乙腈用量在15 mL時，氟吡菌胺回收率達(dá)到最高值，平均回收率在90%以上. 顯然少量的乙腈不能夠?qū)⒛繕?biāo)物質(zhì)完全的萃取，隨著乙腈用量增加，氟吡菌胺萃取效果達(dá)到最優(yōu)，回收率達(dá)到最高值，但隨著萃取溶劑用量不斷增加，萃取達(dá)到相對動態(tài)平衡，回收率變化不明顯. 通過試驗最終確定萃取溶劑乙腈用量最佳為15 mL.

2.2.4 靜態(tài)萃取時間和萃取壓力的選擇 分別設(shè)定靜態(tài)萃取時間為2、3、5、8、10、12 min，考察萃取回收率。圖7顯示，萃取5 min時，回收率在90%以上，再延長萃取時間，目標(biāo)物的回收率基本不變，故靜態(tài)萃取時間選擇5 min。分別選擇50、70、100、120和150 psi萃取壓力，考察回收率的變化，結(jié)果見圖8. 可見，氟吡菌胺的萃取回收率隨著萃取壓力的增加而逐漸提高，在100、120和150 psi萃取壓力下，回收率無明顯變化，因此，萃取壓力確定為100 psi.

圖7 萃取時間對氟吡菌胺回收率的影響

圖8 萃取壓力對氟吡菌胺回收率的影響

2.3 液相色譜和質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化分別考察了甲醇-10 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液、甲醇-5 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液、甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相對氟吡菌胺分析的影響，結(jié)果顯示，甲醇-5 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液為流動相時，目標(biāo)物峰形最佳，響應(yīng)最靈敏.

文獻(xiàn)報道的氟吡菌胺液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法一般采用電噴霧離子正離子模式[5]，本文中在全掃描模式下對比了正、負(fù)離子模式下氟吡菌胺的響應(yīng)，結(jié)果表明，在正離子模式下氟吡菌胺靈敏度更高，因此選擇正離子模式進(jìn)行分析.在MS/MS模式中，以錐孔電壓48 V進(jìn)行目標(biāo)物的子離子檢測，以豐度最大(m/z)172.9作為定量離子，以次靈敏響應(yīng)離子m/z364.9作為定性離子，優(yōu)化質(zhì)譜分析參數(shù)見表2.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限將氟吡菌胺標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用乙腈逐級稀釋成0.025 μg/mL、0.050 μg/mL、0.125 μg/mL、0.250 μg/mL、0.500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，準(zhǔn)確稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性試樣5 g(精確至0.01 g)，分別加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液200 μL，與試樣同時進(jìn)行提取，制成最終濃度為5.00 ng/mL、10.0 ng/mL、25.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。按儀器條件對系列進(jìn)行測定，在5.00～100 ng/mL范圍內(nèi)，濃度值與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=48 697X-4 711，相關(guān)系數(shù)R2>0.999 0，定量限為1.00 μg/kg.

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗稱取6份5 g樣品，在線性范圍內(nèi)分別加入低、中、高系列濃度分析物，按照前處理過程和儀器條件對6份樣品進(jìn)行測定，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)和加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3所示.

表3 精密度和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果 (n=6)

2.6 樣品測定隨機抽取三家菜市場，每一菜市場選取2種日常食用蔬菜，分別為白菜、西藍(lán)花、西紅柿、黃瓜、芹菜和四季豆，按照本方法的前處理和儀器條件進(jìn)行分離分析，結(jié)果在上述蔬菜中均未檢測出氟吡菌胺殘留.同時，對種植過程中噴灑了氟吡菌胺農(nóng)藥的芹菜和白菜分別進(jìn)行殘留量測定，結(jié)果見表4.其中，芹菜和白菜的施藥劑量均為953(a.i.) g/hm2，施藥次數(shù)均為3次，采集樣品時間至最后一次施藥完成后的第7 d.

表4 氟吡菌胺在芹菜和白菜中的殘留量 (μg/kg，n=3)

3 結(jié)論

本工作建立了以乙腈提取，加壓溶劑萃取-高效液相色譜-三重四級串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性食品中氟吡菌胺殘留量的方法，提取方法操作簡單，目標(biāo)化合物損失小，準(zhǔn)確度高，且方法線性良好、精密度、準(zhǔn)確度均能滿足定量限在1.00 μg/kg的檢測分析要求，適用于植物源性食品中氟吡菌胺農(nóng)藥殘留量的檢測.