秦 超，馮永海，楊閃閃，郭 迪

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 410052；2.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 410052)

肺癌發(fā)病率和致死率高，其中非小細(xì)胞肺癌約占80%，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌是最主要的2種類(lèi)型[1-3]。目前，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療以順鉑為基礎(chǔ)的化學(xué)治療為主，或聯(lián)合靶向藥物治療，但其對(duì)化學(xué)治療藥物的多藥耐藥及腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是中晚期患者死亡的主要原因[4-5]。因此，探討肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的多藥耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)其對(duì)化學(xué)治療藥物的耐藥性是提高化學(xué)治療效果的關(guān)鍵。有研究顯示，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer 1,MACC1)可通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)及其受體細(xì)胞間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-Met)的表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[6-7]。本研究旨在探討MACC1表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1月至2019年12月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的新鮮肺腺癌組織標(biāo)本37例和肺鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本23例，所有患者術(shù)前未行放射治療、化學(xué)治療。37例肺腺癌患者中，男24例，女13例，年齡36～79(56.37±6.17)歲；有吸煙史28例，無(wú)吸煙史9例；組織分化程度：高分化12例，中分化19例，低分化6例；TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期3例，Ⅲa期11例，Ⅲb期13例，Ⅳ期8例。23例肺鱗狀細(xì)胞癌患者中，男16例，女7例，年齡39～79(55.62±6.33)歲；有吸煙史17例，無(wú)吸煙史6例；組織分化程度：高分化4例，中分化15例，低分化4例；TNM分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲa期9例，Ⅲb期8例，Ⅳ期2例。

1.2 試劑與儀器小牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、I型膠原酶、二甲基亞砜、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；LEPGEN-96全自動(dòng)醫(yī)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購(gòu)自北京樂(lè)普醫(yī)療科技有限公司，DG5033酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自南京華東電子團(tuán)體醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司，ZT-10臺(tái)式紫外透射儀購(gòu)自美國(guó)精騏公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)切取1 cm×1 cm×1 cm無(wú)壞死新鮮癌組織，立即放入含100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素、5 mg·L-1兩性霉素B的Hanks液培養(yǎng)瓶中，30 min內(nèi)于超凈工作臺(tái)以Hanks液反復(fù)沖洗，去除組織塊表面的穢物、血管和凝血塊等，分割為l mm×l mm×l mm的組織塊；將組織塊移至含2 g·L-1Ⅰ型膠原酶的2 mL消化液中，37 ℃消化6 h；以20 mL Hanks液稀釋消化液，過(guò)200目網(wǎng)，800×g離心10 min，取沉淀，以Hanks液清洗，800×g離心10 min，棄上清，獲得原代癌細(xì)胞。以含100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素及體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為5×108L-1，錐蟲(chóng)藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)達(dá)97%以上即為原代細(xì)胞。將單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔加入單細(xì)胞懸液100 μL，加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)72 h后進(jìn)行細(xì)胞傳代，培養(yǎng)至第2代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性取第2代肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌細(xì)胞，接種于96孔板，每孔接種5 000個(gè)癌細(xì)胞，將肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌細(xì)胞分別均分為順鉑組和對(duì)照組，順鉑組細(xì)胞每孔加入3.0 mg·L-1順鉑10 μL，培養(yǎng)72 h；對(duì)照組細(xì)胞每孔按原代細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h。然后，2組細(xì)胞每孔加入5 g·L-1MTT 10 μL，孵育4 h，250×g離心10 min，棄上清；每孔加入二甲基亞砜50 μL，溶解沉淀，振搖30 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-加藥孔吸光度值/無(wú)藥孔吸光度值)×100%。細(xì)胞增殖抑制率≤30%為耐藥，31%～50%為低度敏感，51%～70%為中度敏感，>70%為高度敏感。低度敏感、中度敏感和高度敏感定義為對(duì)藥物敏感。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白的表達(dá)切取1 cm×1 cm×1 cm無(wú)壞死新鮮癌組織，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，切片經(jīng)梯度乙醇脫蠟至水，抗原修復(fù)20 min，體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫靜置15min，兔血清工作液37 ℃封閉30 min；一抗4 ℃孵育8 h，二抗室溫孵育1 h，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染5 min；自來(lái)水沖洗3次，每次30 s；常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明處理，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。MACC1蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈淺黃色、黃色、棕褐色，表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。隨機(jī)選取10個(gè)高倍(×400)視野，每個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，陽(yáng)性細(xì)胞率≤25%為陰性(-)，26%～50%為弱陽(yáng)性(+)，51%～75%為中等陽(yáng)性(++)，>75%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MACC1 mRNA的表達(dá)取第2代肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌細(xì)胞0.1 g，TRIzol裂解，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參進(jìn)行PCR反應(yīng)。MACC1上游引物序列為5′-CCTAAGTCGTGTAGTAGGAT-3′，下游引物序列為5′-TCGGTCAGGAAGAATTGC-3′，長(zhǎng)度481 bp；GADPH上游引物序列為5′-ACGGACCGCTACAGTGAC-3′、下游引物序列為5′-TCGACGATACTGACGAC-3′，長(zhǎng)度319 bp。PCR反應(yīng)過(guò)程：95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，70 ℃、50 s，70 ℃、1 min，循環(huán)30次。100 g·L-1聚丙烯酰胺凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外透射儀波長(zhǎng)320 nm下觀察電泳條帶，然后以Bandleader 3.0軟件分析PCR目的條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值，采用2-△△Ct法計(jì)算MACC1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的敏感性結(jié)果見(jiàn)表1。37例肺腺癌患者對(duì)順鉑的敏感率為59.46%(22/37)，耐藥率為40.54%(15/37)；23例肺鱗狀細(xì)胞癌患者對(duì)順鉑的敏感率52.17%(12/23)，耐藥率為47.83%(11/23)；肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的敏感性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.849，P>0.05)。

表1 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的敏感性比較

2.2 肺癌組織分化程度與順鉑耐藥性的關(guān)系高、中、低分化肺腺癌對(duì)順鉑的耐藥率分別為41.67%(5/12)、42.11%(8/19)、33.33%(2/6)；高、中、低分化肺腺癌對(duì)順鉑的耐藥率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.916，P>0.05)。高、中、低分化肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率分別為50.00%(2/4)、46.67%(7/15)、50.00%(2/4)；高、中、低分化肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.527，P>0.05)。高、中、低分化的肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.014、1.034、1.679，P>0.05)。

2.3 肺癌TNM分期與順鉑耐藥性的關(guān)系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期肺腺癌對(duì)順鉑的耐藥率分別為0.00%(0/2)、33.33%(1/3)、36.36%(4/11)、38.46%(5/13)、62.50%(5/8)；隨著TNM分期升高，肺腺癌對(duì)順鉑的耐藥率升高(χ2=21.417，P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率分別為0.00%(0/1)、33.33%(1/3)、44.44%(4/9)、50.00%(4/8)、100.00%(2/2)；隨著TNM分期升高，肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率升高(χ2=19.034，P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa期肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.327、0.159、0.827，P>0.05)；Ⅲb、Ⅳ期肺腺癌對(duì)順鉑的耐藥率顯著低于肺鱗狀細(xì)胞癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.361、10.357，P<0.05)。

2.4 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.119，P>0.05)。

A：肺腺癌；B：肺鱗狀細(xì)胞癌。

表2 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白表達(dá)比較

2.5 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MACC1 mRNA表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)圖2。肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.217±0.012、1.137±0.011，肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中MACC1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.137，P>0.05)。

1：肺腺癌；2：肺鱗狀細(xì)胞癌；M：marker。

2.6 肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白表達(dá)與順鉑耐藥性的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表3和表4。肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白表達(dá)與順鉑耐藥性呈正相關(guān)(r= 0.747、0.681，P<0.05)。

表3 肺腺癌組織中MACC1蛋白表達(dá)與順鉑敏感性的關(guān)系

表4 肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白表達(dá)與順鉑敏感性的關(guān)系

3 討論

肺癌是我國(guó)目前發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，腺癌和鱗狀細(xì)胞癌是肺癌重要的2種類(lèi)型，患者就診時(shí)往往已為中晚期，喪失了手術(shù)時(shí)機(jī)，故其臨床治療以化學(xué)治療為基礎(chǔ)，輔以放射治療、靶向治療、免疫治療等，其治療效果與癌細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療藥物的敏感性相關(guān)。順鉑是肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌常用的化學(xué)治療藥物，但順鉑耐藥性導(dǎo)致臨床療效不理想，患者總體生存率較低。因此，尋找導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的可能機(jī)制是臨床提高肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。MACC1是HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的調(diào)節(jié)因子，在肺癌組織細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，此異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-9]。關(guān)于MACC1與肺癌的多藥耐藥性的相關(guān)性研究表明，抑制MACC1的表達(dá)可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性減少順鉑耐藥[3，5]。本研究以新鮮肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本為研究對(duì)象，并分離培養(yǎng)出肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，探討MACC1表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌細(xì)胞順鉑耐藥性的相關(guān)性，以期為臨床治療肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，37例肺腺癌和23例肺鱗狀細(xì)胞癌患者對(duì)順鉑的耐藥率分別為40.54%(15/37)、47.83%(11/23)，肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表明肺腺癌與肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑均有較高的耐藥率。有研究表明，肺癌、肝癌等腫瘤呈浸潤(rùn)性或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)腫瘤細(xì)胞MACC1異常高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性相關(guān)[1，5，10]。本研究結(jié)果顯示，隨著TNM分期升高，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑的耐藥率升高；提示肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移與順鉑耐藥性有關(guān)。

研究表明，MACC1是HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生變化有關(guān)；HGF能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞遷移和離散；c-Met是HGF受體，參與編碼酪氨酸激酶，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲性，MACC1與c-Met啟動(dòng)子區(qū)的SP1位點(diǎn)結(jié)合激活c-Met并轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而啟動(dòng)磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、信號(hào)傳遞與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and activator of transcription,STAT)及促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及血管增生，從而參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展；MACC1激活HGF/c-Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性，通過(guò)PI3K、STAT及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活多藥耐藥基因，介導(dǎo)多藥耐藥[11-13]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白及mRNA的表達(dá)無(wú)差異，且肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌組織中MACC1蛋白表達(dá)與耐藥性呈正相關(guān)，提示MACC1可能與肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑均有較高的耐藥率，MACC1表達(dá)與順鉑耐藥性呈正相關(guān)，MACC1可能參與了肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌對(duì)順鉑耐藥的發(fā)生機(jī)制，但其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。