喬建新，劉熙鵬，劉 明，曹 兵

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 張家口 075000)

腦卒中在致死性疾病譜中僅次于心臟疾病和惡性腫瘤，居第3位，其中約80%為缺血性腦卒中，致殘率、致死率高，嚴重威脅人類的生命健康。通過靜脈藥物溶栓，及時恢復血流灌注以挽救缺血半暗帶細胞，降低腦組織不可逆性損傷，縮小梗死灶是改善缺血性腦卒中患者預后的關鍵。病理生理學研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)后由于能量代謝障礙和線粒體呼吸鏈受阻而導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量產(chǎn)生[1]，病理性刺激炎癥因子大量釋放[2]，進而加重缺血區(qū)腦組織損傷。尼莫地平(nimodipine，NMP)是臨床上防治缺血性腦血管病、血管性癡呆等疾病的常用藥物，并且NMP也是腦IR相關動物實驗研究常用的陽性對照藥物[3-4]。加貝酯(gabexate mesilate，GM)是一種非肽類酶抑制劑，目前臨床上主要用于治療急性輕型(水腫型)胰腺炎。有研究發(fā)現(xiàn)，GM能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡對肝臟缺血再灌注損傷[5]、小腸缺血再灌注損傷[6]起到保護作用，但GM是否對腦IR大鼠腦組織病理改變具有保護作用，相關文獻報道尚不多見，基于此，本研究探討了GM對IR大鼠腦組織病理學改變的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級7周齡Sprague Dawley雄性大鼠240只，體質量(230±10)g，購自承德醫(yī)學院實驗動物中心[許可證號：SCXK(冀)2017-001]。適應性飼養(yǎng)1周后開展實驗研究。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(25±1)℃、相對濕度(60±5)℃、12 h光照黑暗交替，自由飲水進食。

1.2 藥物、試劑與儀器注射用甲磺酸GM購自成都天臺山制藥有限公司(國藥準字H20066191)，注射用NMP購自北京四環(huán)科寶制藥有限公司(國藥準字H20050652)；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、β-actin單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；CUT 4050型切片機購自德國Leica公司，Mini-PROTEAN3型電泳槽、Trans-Blot型轉印槽購自美國Bio-Rad公司，BX43型倒置光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，MR-96A型酶標儀購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，Allegra 21R型低溫離心機購自美國Beckman公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及各組干預措施將240只大鼠進行數(shù)字編碼后，按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、IR組、NMP組和5、10、20 mg·kg-1·d-1GM組，每組40只。除假手術組外，其余各組大鼠參照潘洲佳等[7]報道的線栓法制備腦IR模型；假手術組除不在頸外動脈切口和插入線栓外，其余步驟同IR組。精確稱取GM和NMP粉針劑加入適量生理鹽水制備濃度分別為5、10、20 g·L-1的GM溶液和2 g·L-1的NMP溶液。造模完成后，5、10、20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠經(jīng)尾靜脈注射5、10、20 g·L-1的GM溶液，NMP組大鼠經(jīng)尾靜脈注射 2 g·L-1的NMP溶液，假手術組和IR組大鼠經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水溶液；各組大鼠注射劑量均為 1 mL·kg-1，每日1次，連續(xù)7 d。給藥結束后 6 h行各指標檢測。

1.3.2 各組大鼠神經(jīng)功能評分末次給藥2 h后，隨機取各組大鼠8只，參照ZAUSINGER等[8]報道的Zausinger評分法評估大鼠神經(jīng)功能。0分：行走能力喪失；1分：能走動但向左側旋轉；2分：提起鼠尾，頭頸部向左側旋轉；3分：缺血對側推檔阻力下降；4分：左前肢不能伸直、肘彎曲、抱爪；5分：無神經(jīng)功能缺失。由2名實驗人員對照評分標準獨立進行評分，得分越低，表示神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.3.3 各組大鼠血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)通透性檢測取神經(jīng)功能評分后的各組大鼠8只，參考邱珂等[9]報道的方法，經(jīng)尾靜脈注射質量分數(shù)2%的伊文思藍溶液(4 mL·kg-1)，1 h后麻醉大鼠，開胸暴露心臟，快速心臟灌注300 mL 生理鹽水，斷頭取腦并稱量右半側腦質量。腦組織研磨勻漿后加入其3倍體積的體積分數(shù)50%甲酰胺溶液，60 ℃孵育24 h后1 500 r·min-1離心10 min(離心半徑15 cm)，取上清液，采用酶標儀測定波長610 nm處吸光度值，然后根據(jù)標準曲線計算伊文思藍含量，腦組織中伊文思藍含量代表BBB通透性。

1.3.4 各組大鼠腦組織含水量檢測末次給藥2 h后，隨機取各組大鼠8只，麻醉后斷頭取腦，去除小腦、腦干后稱量右側大腦質量為濕重(W1)，置于95 ℃烘烤箱24 h至質量不再減少后稱質量為干重(W2)，含水量=(W1-W2)/W1×100%。

1.3.5 各組大鼠腦組織病理學變化和細胞凋亡情況觀察末次給藥2 h后，隨機取各組大鼠8只，麻醉后依次心臟灌注300 mL 生理鹽水、300 mL 40 g·L-1多聚甲醛溶液，然后斷頭取腦，去除小腦、腦干后將右側大腦置于40 g·L-1多聚甲醛溶液再固定72 h，然后石蠟包埋、切片、二甲苯透明、梯度乙醇水化。其中一部分切片行常規(guī)蘇木精伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色(蘇木精染色10 min、伊紅水染色3 min、體積分數(shù)1%鹽酸酒精分化3 s)，中性樹脂封片后通過倒置光學顯微鏡觀察大鼠腦組織病理學改變。另一部分切片按照TUNEL試劑盒說明書進行處理，體積分數(shù)50%甘油封片后通過光學顯微鏡觀察細胞凋亡狀況，細胞核染色黃褐色為凋亡細胞。選取每只大鼠相同位置5張TUNEL染色切片，計數(shù)5個不重疊視野內凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.3.6 各組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞超微結構觀察末次給藥2 h后，隨機取各組大鼠8只，頸椎脫臼處死后迅速斷頭取腦，冰上去除小腦、腦干后取右側大腦，切取右側缺血區(qū)5 mm厚大腦皮層組織，4 ℃下體積分數(shù)4%戊二醛溶液固定24 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered salice,PBS)溶液浸泡洗滌3次，4 ℃下體積分數(shù)1%鋨酸固定3 h，雙蒸水浸泡洗滌3次，無水丙酮脫水、氧化丙烯置換、Epon812環(huán)氧樹脂浸透包埋后，80 nm厚度超薄切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重電子染色后通過透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)細胞超微結構。

1.3.7 各組大鼠腦組織中生物化學指標檢測末次給藥2 h后，取各組剩余的8只大鼠，頸椎脫臼處死后迅速斷頭取腦，冰上去除小腦、腦干后取右側大腦，剪碎后加入9倍量4 ℃裂解液研磨勻漿。取部分腦組織勻漿液，3 500 r·min-1離心10 min(離心半徑15 cm)，取上清液，分別采用黃嘌呤氧化酶法、高錳酸鉀滴定法測定SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量；取剩余部分腦組織勻漿液，4 ℃下 12 000 r·min-1離心20 min(離心半徑15 cm)，取上清，提取總蛋白并測定總蛋白濃度，沸水浴高溫變性后，取 40 μg總蛋白量上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉聚偏氟乙烯膜，質量分數(shù)5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，滴加兔抗鼠NF-κB、β-actin一抗后4 ℃孵育過夜，PBS溶液洗膜后滴加山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后滴加二氨基聯(lián)苯胺溶液顯色，以β-actin為內參，以目的條帶灰度值與內參蛋白灰度值的比值作為NF-κB蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、BBB通透性及腦組織含水量比較結果見表1。IR組大鼠神經(jīng)功能評分顯著低于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5 mg·kg-1·d-1GM組大鼠神經(jīng)功能評分與IR組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠神經(jīng)功能評分顯著高于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠神經(jīng)功能評分顯著高于5 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 mg·kg-1·d-1GM組與10 mg·kg-1·d-1GM組大鼠神經(jīng)功能評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；5 mg·kg-1·d-1GM組、10 mg·kg-1·d-1GM組、NMP組大鼠神經(jīng)功能評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 6組大鼠神經(jīng)功能評分、BBB通透性及腦組織含水量比較

IR組大鼠腦組織中伊文思藍含量顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中伊文思藍含量與IR組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中伊文思藍含量顯著低于IR組和5 mg·kg-1·d-1GM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；20 mg·kg-1·d-1GM組伊文思藍含量顯著低于10 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10 mg·kg-1·d-1GM組伊文思藍含量與NMP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

IR組大鼠腦組織含水量顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中含水量與IR組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織含水量顯著低于IR組和5 mg·kg-1·d-1GM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織含水量顯著低于10 mg·kg-1·d-1GM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10、20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織含水量與NMP組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠腦組織病理學改變結果見圖1。假手術組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞形態(tài)、結構均未見異常；IR組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞數(shù)量減少、間隙增大、排列無序，胞體皺縮呈空泡狀變性、細胞核固縮深染；5、10 mg·kg-1·d-1GM組大鼠神經(jīng)細胞數(shù)量減少、間隙增大，胞體皺縮呈空泡狀變性、細胞核固縮深染；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠少量神經(jīng)細胞胞體皺縮、細胞核固縮深染；NMP組大鼠腦組織中神經(jīng)細胞數(shù)量減少，部分胞體皺縮、細胞核固縮深染。

A：假手術組；B：IR組；C：5 mg·kg-1·d-1GM組；D：10 mg·kg-1·d-1GM組；E：20 mg·kg-1·d-1GM組；F：NMP組。

2.3 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較結果見圖2。假手術組、IR組、5 mg·kg-1·d-1GM組、10 mg·kg-1·d-1GM組、20 mg·kg-1·d-1GM組及NMP組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)分別為(3.57±0.59)%、(46.18±7.24)%、(39.75±5.96)%、(32.87±5.63)%、(24.06±4.29)%、(29.53±4.45)%。IR組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)顯著高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5、10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)顯著低于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)顯著低于5 mg·kg-1·d-1GM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)顯著低于10 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠神經(jīng)細胞凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

A：假手術組；B：IR組；C：5 mg·kg-1·d-1GM組；D：10 mg·kg-1·d-1GM組；E：20 mg·kg-1·d-1GM組；F：NMP組。

2.4 各組大鼠神經(jīng)細胞超微結構比較結果見圖3。假手術組大鼠神經(jīng)細胞形態(tài)結構正常，核膜、核仁邊界清晰，線粒體、高爾基體、粗面內質網(wǎng)等細胞器清晰可見且結構未見異常；IR組大鼠神經(jīng)細胞可見細胞膜破裂、細胞質溶解，核膜破裂呈片狀均質性變化，核仁邊界不清，線粒體腫脹、嵴斷裂溶解、內間隙增寬，呈空泡樣變性，粗面內質網(wǎng)擴張、顆粒脫落，高爾基體擴張腫脹等超微結構改變；5 mg·kg-1·d-1GM組大鼠神經(jīng)細胞可見細胞膜破裂、細胞質溶解，核膜破裂，核仁邊界不清，線粒體腫脹、嵴斷裂溶解，粗面內質網(wǎng)擴張、顆粒脫落，高爾基體擴張腫脹等超微結構改變；10 mg·kg-1·d-1GM組大鼠部分神經(jīng)細胞可見細胞膜破裂、細胞質溶解，線粒體腫脹，粗面內質網(wǎng)和高爾基體擴張等超微結構改變；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠少量神經(jīng)細胞可見細胞膜破裂，線粒體輕度腫脹，粗面內質網(wǎng)輕度擴張等超微結構改變；NMP組大鼠部分神經(jīng)細胞可見細胞膜破裂，線粒體輕度腫脹，粗面內質網(wǎng)和高爾基體擴張等超微結構改變。

A：假手術組；B：IR組；C：5 mg·kg-1·d-1GM組；D：10 mg·kg-1·d-1GM組；E：20 mg·kg-1·d-1GM組；F：NMP組。

2.5 各組大鼠腦組織中SOD、CAT活性及MDA水平比較結果見表2。與假手術組比較，IR組大鼠腦組織中SOD、CAT活性顯著降低，MDA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與IR組比較，10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中SOD、CAT活性顯著升高，MDA水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5 mg·kg-1·d-1GM組與IR組大鼠腦組織中SOD、CAT活性和MDA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與5 mg·kg-1·d-1GM組比較，10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中MDA水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中SOD、CAT活性顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；10 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中SOD、CAT活性與5 mg·kg-1·d-1GM組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與10 mg·kg-1·d-1GM組比較，20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中SOD活性顯著升高，MDA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；20 mg·kg-1·d-1GM組與10 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中CAT活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；NMP組大鼠腦組織中SOD、CAT活性及MDA水平與10 mg·kg-1·d-1GM組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與20 mg·kg-1·d-1GM組比較，NMP組大鼠腦組織中SOD活性顯著升高，MDA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NMP組與20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中CAT活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 6組大鼠腦組織中SOD、CAT活性及MDA含量比較

2.6 各組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量比較結果見圖4。假手術組、IR組、5 mg·kg-1·d-1GM組、10 mg·kg-1·d-1GM組、20 mg·kg-1·d-1GM組及NMP組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量分別為0.08±0.03、0.91±0.14、0.76±0.12、0.18±0.06、0.10±0.03、0.21±0.07。IR組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；5、10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量顯著低于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；10、20 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量顯著低于5 mg·kg-1·d-1GM組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量顯著低于10 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組(P<0.01)；10 mg·kg-1·d-1GM組和NMP組大鼠腦組織中NF-κB蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

腦組織是能量消耗最大的器官，耗氧量占全身耗氧量20%以上，但腦組織糖原儲存量較低，缺血5 min即可出現(xiàn)不可逆損傷，導致神經(jīng)功能缺損而致殘、致死。采用靜脈藥物溶栓或介入手術及時恢復血流再灌注和氧供給，減輕腦組織損傷、縮小梗死灶是改善缺血性腦卒中患者預后的關鍵，但IR并發(fā)癥的存在卻嚴重影響著治療結局。

氧化應激損傷以及繼發(fā)性神經(jīng)細胞凋亡是腦IR損傷的病理基礎[10]。腦缺血急性期及再灌注過程中產(chǎn)生大量ROS，ROS攻擊腦神經(jīng)細胞膜生成的環(huán)氧酶2，可誘導花生四烯酸進一步生成ROS，線粒體結構和功能受損也會釋放大量的ROS[11-12]。ROS過量生成致使以ROS為底物的抗氧化酶SOD、GSH-Px被過度消耗，造成機體ROS蓄積，進而攻擊核酸、蛋白質等大分子物質，使其生成具有生物毒性的MDA[13]；此外，ROS可攻擊細胞膜，破壞細胞骨架，降解跨膜蛋白、胞質附著蛋白，破壞緊密連接蛋白復合體(BBB重要組成部分)，破壞BBB結構[14]，進而導致血管源性腦水腫，腦水腫是缺血性腦病致殘、致死的主要原因之一。劉倩等[15]研究發(fā)現(xiàn),NMP能夠改善抗氧化酶活性、抑制氧化應激反應而減輕腦IR損傷。

抑制神經(jīng)細胞凋亡，挽救缺血半暗帶瀕死細胞是減輕缺血性腦損傷的關鍵。NF-κB是由p50和p65組成的二聚體(p50-p65)，參與氧化應激、細胞凋亡等過程的調控[16]。靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制因子IkB結合(p50-p65-IkB)后處于無活性狀態(tài)，但在ROS作用下，IkB被解離而暴露，p50亞基上的易位信號和p65亞基上的DNA結合位點，使NF-κB活化并從細胞質轉移至細胞核而促進凋亡相關基因轉錄表達[17-18]。

本研究結果顯示，經(jīng)GM或NMP干預治療7 d均能夠明顯改善腦IR大鼠神經(jīng)功能，降低BBB通透性和腦組織含水量，改善神經(jīng)細胞數(shù)量減少、排列無序、胞體皺縮、細胞核固縮深染等病理學改變；抑制腦組織神經(jīng)細胞胞膜破裂、細胞質溶解、核膜破裂及線粒體腫脹、粗面內質網(wǎng)和高爾基體擴張等超微結構病變；減少神經(jīng)細胞凋亡；提高抗氧化酶(SOD、CAT)活性并降低MDA含量，下調NF-κB表達。20 mg·kg-1·d-1GM對腦IR大鼠神經(jīng)功能、BBB通透性的保護作用優(yōu)于NMP，對腦組織病變、神經(jīng)細胞超微結構病變和神經(jīng)細胞凋亡的抑制作用優(yōu)于NMP；20 mg·kg-1·d-1GM組大鼠腦組織中SOD活性高于NMP組，MDA水平和NF-κB蛋白相對表達量低于NMP組。提示GM對腦IR大鼠腦組織病理學改變、神經(jīng)細胞超微結構病變具有抑制作用，對BBB通透性具有保護作用，其機制可能與降低氧化應激、下調NF-κB蛋白表達以及抑制細胞凋亡有關；較高劑量GM對腦IR大鼠腦組織的保護作用優(yōu)于NMP。