張 媛，王莉華，郭 燕，劉憲凱，呂國(guó)慶，黃 琰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液一科，河南 衛(wèi)輝 453100)

白血病是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和病死率在兒童及青少年癌癥中居首位[1-2]。近年來(lái)，雖然免疫治療在白血病的治療中取得了較大進(jìn)展，但化學(xué)治療在白血病的治療中仍占至關(guān)重要地位[3]。因此，尋找有效的化學(xué)治療藥物并研究其作用機(jī)制對(duì)白血病的治療意義重大[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，青光眼、糖尿病、冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、癌癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳有著密切關(guān)系[7]。甲基化修飾是哺乳動(dòng)物中最常見(jiàn)的RNA修飾，該修飾過(guò)程可逆，由甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3(methyltransferase like 3，METTL3)、甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(methyltransferase like 14，METTL14)、腎母細(xì)胞瘤1-結(jié)合蛋白(Wilms tumor1-associating protein，WTAP)所組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體及去甲基化酶脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO)、α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶AlkB同源蛋白5(AlkB homolog 5，ALKBH5)以及閱讀器YTH結(jié)構(gòu)域家庭蛋白(YTH domain-containing family protein，YTHDF)家族等共同調(diào)控[8-9]。研究表明，腫瘤細(xì)胞的甲基化水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及耐藥等密切相關(guān)[10-13]。FTO是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)去甲基化酶活性的蛋白質(zhì)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO在急性髓細(xì)胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著癌基因的作用，在混合譜系白血病(mixed-lineage leukemia，MLL)中呈高表達(dá)，右旋二羥基戊二酸[(2R)-2-hydroxyglutarate，R-2-HG]可通過(guò)FTO/m6A/MYC/CEBPA途徑發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用[15-17]。大黃酸是一種天然的蒽醌衍生物，可增加全反式維甲酸誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞分化[18]。同時(shí)，大黃酸也是RNA去甲基化酶FTO的抑制劑，可以降低細(xì)胞中FTO表達(dá)水平[19]。本研究擬通過(guò)研究不同濃度大黃酸對(duì)不同白血病細(xì)胞FTO表達(dá)及細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討大黃酸治療白血病的機(jī)制，以期為指導(dǎo)白血病臨床用藥提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器白血病細(xì)胞株HL60、NB4、Naml6、THP1購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Corning公司，大黃酸購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量/濃度測(cè)定試劑盒、含體積分?jǐn)?shù)0.05%Tween 20的Tris緩沖液溶液(Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20，TBST)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，膜聯(lián)蛋白Ⅴ-別藻藍(lán)蛋白(annexinⅤ-allophycocyanin，Annexin-Ⅴ-APC)/碘化丙啶(propidine iodide，PI)、Binding buffer 購(gòu)自美國(guó)BD公司，二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人FTO、兔抗人caspase-3、鼠抗人β-actin一抗及羊抗鼠和羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購(gòu)自杭州弗德生物科技有限公司；生物化學(xué)培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，超凈工作臺(tái)、低溫高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific 公司，CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司,蛋白垂直電泳儀、蛋白垂直轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，ChemiScope 3300 Mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組將HL60、NB4、Naml6、THP1細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代。收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL60、NB4、Naml6、THP1細(xì)胞，以每孔 5×103個(gè)細(xì)胞均勻接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機(jī)分為對(duì)照組和10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組分別加入10 μL 終濃度為10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸，對(duì)照組細(xì)胞加入等量的DMSO，并設(shè)空白對(duì)照組(只加100 μL培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)用于增殖抑制率檢測(cè)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各組細(xì)胞加藥后繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖能力取各組HL60、NB4、Naml6、THP1細(xì)胞，于培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)，每孔分別加入10 μL CCK-8試劑，然后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，并計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(對(duì)照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。增殖抑制率越高代表增殖能力越低。

1.2.3 Annexin-Ⅴ-APC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況取各組培養(yǎng)72 h細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌細(xì)胞，加入100 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，再分別加入5 μL的Annexin-Ⅴ-APC和PI，輕輕混勻，冰上避光染色30 min，每管再加入400 μL Binding buffer，使用CytoFLEX LX 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中FTO和caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量取各組培養(yǎng)72 h細(xì)胞，用PBS洗滌2遍，300×g離心5 min后，取細(xì)胞沉淀加入蛋白裂解液，使用BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，1 200×g離心10 min后，取上清液加入5×Loading buffer，100 ℃變性10 min。每孔取100 μg蛋白樣品上樣，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺鈉凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶室溫封閉 1 h，TBST清洗3次，分別加入稀釋后的兔抗人FTO一抗(1:1 000)、兔抗人caspase-3一抗(1:1 000)4 ℃封閉過(guò)夜，TBST清洗3次，然后加入稀釋后二抗(1:5 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗3次，加入ECL發(fā)光液，在暗室中曝光、顯影，使用ChemiScope 3300 Mini化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描、分析灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 5組白血病細(xì)胞增殖抑制率比較結(jié)果見(jiàn)表1。24、48、72 h時(shí)，10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞增殖抑制率高于10 μmol·L-1大黃酸組，40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞增殖抑制率高于20 μmol·L-1大黃酸組，80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞增殖抑制率高于40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。24、48、72 h時(shí)，10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，48、72 h時(shí)，80 μmol·L-1大黃酸組THP1細(xì)胞增殖抑制率高于10、20、40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h時(shí),10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細(xì)胞增殖抑制率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 5組HL60、NB4、Nalm6、THP1細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 5組白血病細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見(jiàn)表2。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組，20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60和NB4細(xì)胞凋亡率高于 10 μmol·L-1大黃酸組，40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60和NB4細(xì)胞凋亡率高于20 μmol·L-1大黃酸組，80 μmol·L-1大黃酸組HL60和NB4細(xì)胞凋亡率高于40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。40、80 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；40 μmol·L-1大黃酸組與80 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組間THP1細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 5組HL60、NB4、Nalm6、THP1細(xì)胞凋亡率比較

2.3 5組白血病細(xì)胞中FTO和caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表3和圖1、圖2、圖3、圖4。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞中FTO蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；20、40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞中FTO蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于10 μmol·L-1大黃酸組，caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著高于10 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；40、80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞中FTO蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于20 μmol·L-1大黃酸組，caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于20 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；80 μmol·L-1大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞中FTO蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于40 μmol·L-1大黃酸組，caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于40 μmol·L-1大黃酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5組THP1細(xì)胞中FTO和caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 5組HL60、NB4、Nalm6、THP1細(xì)胞中FTO和caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

1：對(duì)照組；2：10 μmol·L-1大黃酸組；3：20 μmol·L-1大黃酸組；4：40 μmol·L-1大黃酸組；5：80 μmol·L-1大黃酸組。

1：對(duì)照組；2：10 μmol·L-1大黃酸組；3：20 μmol·L-1大黃酸組；4：40 μmol·L-1大黃酸組；5：80 μmol·L-1大黃酸組。

1：對(duì)照組；2：10 μmol·L-1大黃酸組；3：20 μmol·L-1大黃酸組；4：40 μmol·L-1大黃酸組；5：80 μmol·L-1大黃酸組。

3 討論

近年來(lái)，白血病的發(fā)病率仍在逐年增高，雖然嵌合抗原受體T細(xì)胞的問(wèn)世為很多急性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤等血液腫瘤患者的治療帶來(lái)了希望，但關(guān)于急性髓系白血病相關(guān)靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)仍未取得很好的進(jìn)展，因此，化學(xué)治療和靶向治療仍占據(jù)著至關(guān)重要的地位[6，20-24]。m6A甲基化修飾于20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)，是最常見(jiàn)、最豐富的真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾形式之一[25]，在白血病的發(fā)展過(guò)程中其通過(guò)影響白血病干細(xì)胞目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄分化功能，從而促使白血病的發(fā)生[26]。FTO是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶活性能力的蛋白質(zhì)[14]。WIENER等[12]研究認(rèn)為，F(xiàn)TO作為一種m6A的去甲基化酶，在白血病的發(fā)生以及全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)介導(dǎo)的白血病細(xì)胞分化中起著關(guān)鍵的致癌作用，F(xiàn)TO可通過(guò)降低其關(guān)鍵靶基因如ASB2和RARA基因的m6A水平，從而調(diào)節(jié)白血病細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)信號(hào)通路，改變其生物學(xué)特性。CHEN等[19]報(bào)道，大黃酸是RNA去甲基化酶FTO的抑制劑，可降低細(xì)胞中FTO水平。雖然大黃酸作為一種瀉藥和胃藥已經(jīng)使用了很長(zhǎng)時(shí)間，而且其具有多種藥理活性，如抗癌、抗菌、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血管生成、抗纖維化等[27]，但關(guān)于其在白血病中抗腫瘤作用研究較少。有學(xué)者研究表明，大黃酸能夠通過(guò)活性氧介導(dǎo)的線粒體死亡途徑誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡，但其使用的細(xì)胞類型單一，而且大黃酸作為一種FTO的抑制劑在白血病細(xì)胞中的作用未見(jiàn)報(bào)道[28]。

本研究使用10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸處理白血病細(xì)胞HL60、NB4、Nalm6和THP1，并設(shè)置加入等量的DMSO作為對(duì)照組，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，各濃度大黃酸組HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組，隨大黃酸濃度增加，HL60、NB4、Nalm6細(xì)胞增殖抑制率顯著增高，且呈濃度依賴性。10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細(xì)胞增殖抑制率高于對(duì)照組;10、20、40、80 μmol·L-1大黃酸組THP1細(xì)胞增殖抑制率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果說(shuō)明大黃酸可以抑制M3型急性髓系白血病細(xì)胞HL60和NB4及急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Nalm6的增殖，對(duì)THP1細(xì)胞的增殖則幾乎無(wú)作用。Annexin-Ⅴ-APC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，各濃度大黃酸組HL60、NB4細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，且隨大黃酸濃度增加，HL60、NB4細(xì)胞凋亡率顯著增加，呈濃度依賴性；40、80 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組；對(duì)照組、10 μmol·L-1大黃酸組和20 μmol·L-1大黃酸組Nalm6細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果說(shuō)明大黃酸可以呈濃度依賴性顯著誘導(dǎo)M3型急性髓系白血病細(xì)胞HL60和NB4的凋亡，且對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Nalm6的凋亡有一定作用，而對(duì)THP1的凋亡沒(méi)有明顯作用。由此體外實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)，大黃酸對(duì)M3型急性髓系白血病具有顯著抗腫瘤的作用，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病有一定的抗腫瘤作用。為進(jìn)一步探討其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本研究通過(guò)Western blot法檢測(cè)分析各組細(xì)胞中FTO蛋白和caspase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著大黃酸濃度的增高，白血病細(xì)胞HL60、NB4、Nalm6中FTO蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低，caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增高；而不同濃度大黃酸組THP1細(xì)胞中FTO和caspase-3蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這些結(jié)果提示大黃酸可以通過(guò)抑制FTO的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)M3型急性髓系白血病細(xì)胞HL60和NB4及急性淋巴細(xì)胞Nalm6的凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸可能通過(guò)抑制FTO蛋白表達(dá)誘導(dǎo)M3型AML細(xì)胞HL60和NB4凋亡并抑制其增殖，而且對(duì)急性淋巴白血病細(xì)胞Nalm6也有一定的作用，對(duì)THP1無(wú)明顯作用，這將為大黃酸在白血病的臨床治療中提供依據(jù)。但大黃酸抑制FTO的表達(dá)與PML-RARα融合基因的相關(guān)性以及其下游通路還有待更深入的研究。