袁紅昌，逯中民，陳 穎，朱 煜，楊明瑞，趙金金

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1 藥學(xué)部，2 檢驗(yàn)科，新鄉(xiāng) 453100)

克羅恩病是一種反復(fù)發(fā)作的腸道炎癥疾病，病變部位多見(jiàn)于回腸末端和鄰近結(jié)腸處，有時(shí)可累及整個(gè)消化道。臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、無(wú)肉眼血便或黏液血便，可出現(xiàn)腹部腫塊、肛門(mén)病變及腸瘺等癥狀。中醫(yī)認(rèn)為克羅恩病屬于“泄瀉、痢疾、便血”等范疇，病理過(guò)程類似“肝郁脾虛、脾氣受損”證候。痛瀉要方源于《丹溪心法》[1]，由白芍、白術(shù)、陳皮、防風(fēng)4味中藥組成，是治療肝旺脾虛痛瀉的代表方劑。后世醫(yī)家吳昆《醫(yī)方考》卷二之泄瀉門(mén)曰：“痛瀉不止者，此方主之?！逼⑽笧楹筇熘?，若因外感時(shí)邪、情志失調(diào)、飲食所傷，皆可損傷脾胃，脾胃虛弱，氣血化源不足，導(dǎo)致肝陰血不足，肝用失制，肝氣疏泄太過(guò)，肝旺乘脾，脾虛失運(yùn)，升降失司，水濕不化，濕熱蘊(yùn)積腸胃而發(fā)病，故治療應(yīng)從柔肝祛風(fēng)、健脾溫中化濕[2]。痛瀉要方常用于補(bǔ)脾抑肝，治療肝郁脾虛腹瀉[3]。痛瀉要方的有效成分、作用途徑、靶點(diǎn)多，作用機(jī)制尚未完全闡明[4]。目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已應(yīng)用于中藥學(xué)研究，可直觀地探索中藥與機(jī)體之間的相互作用，從整體水平觀察中藥的療效，為復(fù)雜的作用機(jī)制研究提供了新的方向和思路[5]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)探索痛瀉要方的藥理作用，以及治療克羅恩病的作用機(jī)制。

1 方法

1.1 收集疾病靶點(diǎn)

通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站檢索克羅恩病的疾病基因，物種為“homo sapiens(human)”，查詢“Crohn disease”和“Crohn’s disease”關(guān)鍵詞，采用Pheatmap R包刪除重復(fù)的疾病靶點(diǎn)。通過(guò)篩選閾值(P<0.05)得差異性基因，采用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)進(jìn)行差異性基因分析，logFC>0和logFC<0分別為上調(diào)基因和下調(diào)基因，制作差異基因的火山圖。

1.2 預(yù)測(cè)痛瀉要方的活性成分及靶點(diǎn)

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)網(wǎng)站查詢痛瀉要方中白芍、白術(shù)、陳皮、防風(fēng)4味中藥的活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%以及藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件篩選有效化合物。文獻(xiàn)顯示[6-7]，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ(atractylenolide Ⅰ)和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(atractylenolide Ⅲ)為白術(shù)的主要活性成分，因此本研究納入這2種成分。預(yù)測(cè)活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

篩選痛瀉要方的活性成分和克羅恩病靶點(diǎn)交集的靶點(diǎn)蛋白。利用Cytoscape 3.7.2軟件包構(gòu)建痛瀉要方-克羅恩病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)為痛瀉要方的活性成分和克羅恩病靶點(diǎn)；邊為成分與靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2軟件BisoGenet包構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，PPI數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源于BIOGRID、HPRD、DIP、INTACT、MINT、BIND，物種為“homo sapiens(human)”。利用Cytoscape 3.7.2軟件CytoNCA包對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯x取度中心性(degree centrality，DC)和介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)指標(biāo)大于節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，分析其藥理作用。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

采用ClusterProfiler R包對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析。以P<0.05(閾值)表示生物學(xué)功能有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，制作細(xì)胞組分(cell components，CC)、生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)圖。采用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建基因與KEGG之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，以P<0.05(閾值)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 疾病靶點(diǎn)

經(jīng)收集和篩選后，共得克羅恩病的靶點(diǎn)基因434個(gè)，上調(diào)基因和下調(diào)基因分別為249個(gè)和185個(gè)。見(jiàn)圖1。

注：黑色為對(duì)照組和克羅恩病組無(wú)差異性基因；紅色和綠色分別為克羅恩病組上調(diào)基因和下調(diào)基因圖1 差異性基因的火山圖

2.2 痛瀉要方的成分及靶點(diǎn)

篩選痛瀉要方的活性化合物28個(gè)(數(shù)據(jù)截至2020年5月23日)，包括山柰酚(kaempferol)、芍藥苷(paeoniflorin)、兒茶素[(+)-catechin]等4個(gè)白芍成分；β-乙酰氧基蒼術(shù)酮(β-acetoxyatractylone)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ等5個(gè)白術(shù)成分；柚皮素(naringenin)、米橘素(citromitin)、川陳皮素(nobiletin)等4個(gè)陳皮成分；白花前胡乙素(anomalin)、歐前胡素(ammidin)、防風(fēng)色酮醇(ledebouriellol)等16個(gè)防風(fēng)成分；β-谷甾醇(β-sitosterol)為防風(fēng)和白芍的共同成分。

2.3 化合物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

28個(gè)化合物和15個(gè)疾病靶點(diǎn)構(gòu)成了痛瀉要方-克羅恩病疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，含節(jié)點(diǎn)43個(gè)和邊71條。重要的疾病靶點(diǎn)為二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP4)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2，NOS2)、過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARG)等；痛瀉要方的主要化合物為白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、山柰酚、

川陳皮素等。見(jiàn)圖2和表1。

注：紅色為疾病靶點(diǎn)；黃色、藍(lán)色、灰色、紫色和青色分別為防風(fēng)、白芍、陳皮、白術(shù)及共同成分圖2 痛瀉要方-克羅恩病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)

經(jīng)篩選DC和BC指標(biāo)后得NOS2、腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、微小染色體維持缺陷蛋白2(minichromosome maintenance 2，MCM2)等135個(gè)靶點(diǎn)蛋白。見(jiàn)圖3和表2。

表2 痛瀉要方-克羅恩病靶點(diǎn)的基本信息

(續(xù)表)

2.5 GO功能分析

BP富集較多的有對(duì)細(xì)菌源性分子反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、小分子代謝過(guò)程調(diào)節(jié)(regulation of small molecule metabolic process)、脂肪酸反應(yīng)(response to fatty acid)等566個(gè)生物學(xué)過(guò)程；CC富集較多的有低密度脂蛋白粒子(low-density lipoprotein particle)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)域(membrane region)、內(nèi)體膜(endosome membrane)等28個(gè)生物學(xué)過(guò)程；MF富集較多的有蛋白酶結(jié)合(protease binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、受體配體活動(dòng)(receptor ligand activity)等7個(gè)生物學(xué)過(guò)程。

2.6 KEGG通路富集分析

結(jié)果顯示，15個(gè)靶點(diǎn)在16條信號(hào)通路上富集有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，主要通路為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)信號(hào)通路、百日咳(pertussis)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、核因子-κB(nuclear factor-кB，NF-κB)信號(hào)通路等。

2.7 KEGG與基因關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

結(jié)果顯示，由10個(gè)基因和16條信號(hào)通路構(gòu)成關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，含26個(gè)節(jié)點(diǎn)和43條邊；重要的基因?yàn)榄h(huán)加氧酶2(PTGS2)、趨化因子配體2(CCL2)及白細(xì)胞介素-1β(IL1β)等；重要的KEGG通路為百日咳、IL-17信號(hào)通路、利什曼病及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。見(jiàn)表3。

表3 痛瀉要方-克羅恩病靶點(diǎn)的信號(hào)通路

3 討論

克羅恩病的病因較多，與感染和免疫紊亂等因素有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道[8]，Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3，NLRP3)是一種蛋白復(fù)合體，誘導(dǎo)IL-1β的分泌和成熟，與克羅恩病的發(fā)生高度相關(guān)。當(dāng)結(jié)腸發(fā)生感染和黏膜損傷時(shí)，通過(guò)IL-1β激活刺激T細(xì)胞增殖引起黏膜免疫應(yīng)答?？肆_恩病患者腸組織中Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞數(shù)量增多促進(jìn)白細(xì)胞介素-17A(interleukin，IL-17A)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等細(xì)胞因子分泌增多，表達(dá)上調(diào)，激活NF-κB炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)或加重炎癥反應(yīng)[9-10]。研究表明[11]，克羅恩病是由Th1/Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，IL-17、IFN-γ、TNF-α等高表達(dá)引起效應(yīng)T細(xì)胞與調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化失衡。在克羅恩病發(fā)生過(guò)程中，TNF-α誘導(dǎo)IL-12促進(jìn)Th1細(xì)胞分化和增殖[12]。活性氧(reactive oxygen species，ROS)作為p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和NF-κB等傳導(dǎo)信使激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡[13]。腸炎患者中 IL-1β 含量升高，但也有報(bào)道稱IL-1β引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植，減輕結(jié)腸炎[14-15]。因此，IL-1β在黏膜免疫應(yīng)答的作用仍未完全闡明。

痛瀉要方由白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)4味中藥組成。中醫(yī)認(rèn)為，白術(shù)利水化濕、健脾燥濕；白芍益陰柔肝、緩急止痛；陳皮理氣燥濕、醒脾健脾、化痰和胃；防風(fēng)理氣止痛、勝濕止瀉，全方歸肺經(jīng)和大腸經(jīng)，通過(guò)補(bǔ)脾抑肝、緩急止痛治療克羅恩病[16]。研究表明[17]，白芍的主要成分有芍藥苷和兒茶素。芍藥苷具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、抗抑郁等生物活性[18]；兒茶素具有抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等作用。陳皮具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗癌等功效，用于治療脘腹脹滿、腹瀉或便秘；陳皮的主要成分有柚皮素、川陳皮素、β-谷甾醇。柚皮素和川陳皮素具有抗氧化、減少氧自由基和抗炎作用[16,19]；β-谷甾醇可抗炎、調(diào)節(jié)免疫。防風(fēng)具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用，可用于胃痛和胃腸炎治療，療效良好；防風(fēng)的主要成分香豆素和色原酮具有抗病毒作用[20]。上述文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)4味中藥的主要成分與TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的化合物靶點(diǎn)基本一致，說(shuō)明采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)痛瀉要方主要靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性較高。

本研究通過(guò)IL-17、NF-κB、TNF等16條信號(hào)通路預(yù)測(cè)了芍藥苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、柚皮素、川陳皮素、β-谷甾醇等28個(gè)活性成分對(duì)克羅恩病的治療作用。白術(shù)可降低IL-1β、TNF-α水平，減輕局部炎癥反應(yīng)[21]，通過(guò)調(diào)節(jié)toll樣受體4(toll-like receptors 4，TLR4)/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制后續(xù)致炎因子生成，恢復(fù)Th1/Th2失衡[21]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ抑制白細(xì)胞分化抗原14(lipopolysacharide 14，又稱CD14)、TLR4、清道夫受體A類(scavenger receptor class A types，SR-A)的表達(dá)，減弱NF-κB活性，通過(guò)抑制TNF-α和IL-6產(chǎn)生抗炎作用[6]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ抑制NLRP3炎性體激活進(jìn)而減少IL-1β[22]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ抑制NO、IL-6、TNF-α釋放，抑制小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。蒼術(shù)酮通過(guò)降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子水平，抑制p65及NF-κB表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)[23-24]。芍藥苷改善2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎TNF-α等因子的合成，促進(jìn)IL-10合成，抑制p38 MAPK激活，抑制TNF-α分泌，減輕結(jié)腸的炎癥[18]。山柰酚通過(guò)MAPK和NF-κB途徑抑制ROS產(chǎn)生[25]，調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。陳皮調(diào)節(jié)IL-17、NF-κB、TNF等信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎、保護(hù)肝臟、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[26]，還可調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號(hào)通路，影響NF-κB信號(hào)通路。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了痛瀉要方治療克羅恩病的作用機(jī)制，為研究中藥復(fù)方效應(yīng)機(jī)制提供一些新思路。但同時(shí)也存在不足之處，如痛瀉要方的入血成分尚未完全明確，成分與疾病靶點(diǎn)的對(duì)接還有待進(jìn)一步探索，以及缺少網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果的臨床和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等，需進(jìn)一步研究。