王亞瓊，鐘水生，張華鋒

(蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，蘇州 215104)

藥品的無菌檢驗(yàn)和微生物限度是藥品質(zhì)量及監(jiān)管中涉及安全性的重要檢查指標(biāo)?！吨袊幍洹穂1](2020年版)中新設(shè)立了中藥提取物和中藥飲片的微生物限度，新修訂的《中華人民共和國藥品管理法》[2](以下簡稱新版《藥品管理法》)于2019年12月1日起施行。新版《藥品管理法》加大了對(duì)生產(chǎn)銷售偽劣藥品的處罰力度，微生物檢驗(yàn)不合格的藥品屬于劣藥的范疇。目前中藥常用滅菌方法以濕熱滅菌和輻照滅菌為主，隨著現(xiàn)代工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，輻照已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化的應(yīng)用。由于輻照不會(huì)引起被輻照物的溫度明顯升高，對(duì)熱敏性中藥的殺菌有一定的優(yōu)越性，同時(shí)由于大規(guī)格的樣品滅菌非常便捷且成本低，使輻照滅菌的應(yīng)用越來越普遍[3]。但有研究表明[3-11]，輻照滅菌對(duì)中藥的有效成分并非毫無影響，超過5 kGy的輻照劑量會(huì)導(dǎo)致多個(gè)有效化學(xué)成分含量降低。水蛭作為《Co60輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》[12]中允許輻照的藥材品種，盡管有研究表明輻照對(duì)日本醫(yī)蛭提取物活性無影響[13]，但目前尚無針對(duì)輻照對(duì)水蛭藥材活性影響的相關(guān)研究。本研究以水蛭抗凝血酶活性為指標(biāo)，考察輻照對(duì)目前市場上常用的水蛭活性的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

水蛭藥材樣品于2019年采購自亳州市藥材市場零售攤位，詳細(xì)信息見表1。純水(美國Millpore公司)；12孔細(xì)胞板(美國Corning公司)；牛纖維蛋白原(批號(hào)140626-201611，規(guī)格凝固物含量44%)、凝血酶(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)140625-201712，規(guī)格1180單位/瓶)；0.9%氯化鈉溶液(中國大冢制藥有限公司)；三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液：0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液 25 ml 與0.1 mol/L鹽酸溶液約40 ml，加水至100 ml，調(diào)節(jié)至pH 7.4；三羥甲基氨基甲烷、鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

表1 水蛭樣品信息表

1.2 儀器

AG245電子天平(瑞士Mettler公司)；C-MAG恒溫電熱板(德國IKA公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 輻照條件

樣品送蘇州中核華東輻照有限公司進(jìn)行鈷60γ(60Co-γ)射線輻照，輻照劑量分別為5、10和20 kGy，輻照時(shí)間以輻照強(qiáng)度為準(zhǔn)。

2.2 供試品的制備

取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 ml，振蕩提取30 min，靜置后，3000 r/min離心5 min，精密量取上清液100 μl，置于12孔細(xì)胞板中測定(見圖1)。

圖1 12孔板抗凝血酶活性實(shí)驗(yàn)圖

2.3 測定方法

樣品孔加入含0.5%牛纖維蛋白原(以凝固物計(jì))的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(臨用配制)200 μl，搖勻，置恒溫電熱板上(37±1) ℃、5 min后，滴加每1 ml中含40單位的凝血酶溶液(滴加1次/min，每次5 μl，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固(用于活性較強(qiáng)的樣品)或滴加每1 ml中含10單位的凝血酶溶液(滴加1次/4 min，每次2 μl，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固(用于活性較弱的樣品)，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按公式計(jì)算：U=(C1V1/C2V2)。式中U為每1 g含凝血酶活性單位(U/g)；G為凝血酶溶液的濃度(μ/ml)；C2為供試品溶液的濃度(g/ml)；V1為消耗凝血酶溶液的體積(μl);V2為供試品溶液的加入量(μl)。中和一個(gè)單位的凝血酶量為一個(gè)抗凝血酶活性單位。

2.4 樣品測定

選擇活性較弱的藥典收錄品種寬體金線蛭(螞蟥WhitmaniapigraWhitman)各3批次，活性較強(qiáng)的藥典收錄品種日本醫(yī)蛭(水蛭HirudonipponicaWhitman)各2批次，活性較強(qiáng)的非藥典收錄品種光潤金線蛭(Whitmanialaevis)各2批次及菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis)各3批次，測定其抗凝血酶活性。樣品送輻照，分別接收5、10和20 kGy60Co-γ射線輻照后，再次測定樣品中的抗凝血酶活性，測定結(jié)果見表2。

表2 輻照前后水蛭的抗凝血酶活性影響

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 6.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，作圖2和圖3。組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過One-way ANOVA計(jì)算。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

a:P<0.05圖2 輻照前后水蛭抗凝血酶活性比較

a:P<0.05，b:P<0.01圖3 高活性水蛭組輻照前后抗凝血酶活性比較

3 討論

寬體金線蛭由于抗凝血酶活性弱，不同劑量輻照后抗凝血酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但抗凝血酶活性較強(qiáng)的日本醫(yī)蛭、光潤金線蛭和菲牛蛭在高劑量輻照下活性降低(見圖2和3)；當(dāng)輻照劑量超過10 kGy，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究測定方法參考了《中國藥典》(2020年版)水蛭項(xiàng)下抗凝血酶活性法[11]，實(shí)驗(yàn)中將試管改為12孔細(xì)胞板，水浴改為恒溫?zé)岚?，更便于觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果及大批量樣品的測試(見圖1)。相比傳統(tǒng)的試管法結(jié)果更易觀察，方法更便捷。

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，輻照會(huì)降低高活性水蛭組的抗凝血酶活性，建議對(duì)于具有生物活性的藥材謹(jǐn)慎使用輻照滅菌的方法；如果需要輻照滅菌，建議輻照劑量不宜超過5 kGy。