沈紹寧,吳東曉,呂帥潔,肖魯偉,童培建
(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 310053;2.浙江省中醫(yī)院,浙江 杭州 310006)
血友病是一種X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病,可分為血友病A和血友病B,前者為凝血因子Ⅷ缺乏、后者為凝血因子Ⅸ缺乏,均由相應(yīng)的凝血因子基因突變引起[1]。該病的主要臨床表現(xiàn)為出血。血友病性關(guān)節(jié)炎(hemophilic arthritis,HA)是由血友病患者(people with hemophilia,PWH)關(guān)節(jié)腔內(nèi)反復(fù)出血而引起的關(guān)節(jié)退行性變和滑膜炎癥,是血友病主要的并發(fā)癥之一,嚴(yán)重影響PWH的生活質(zhì)量。目前,臨床上治療HA的方法主要為預(yù)防出血和骨科手術(shù)。凝血因子替代治療是目前預(yù)防血友病出血的主要方法[2],然而替代治療價(jià)格昂貴,在發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用受到限制;該療法主要對(duì)尚未發(fā)生關(guān)節(jié)炎的兒童PWH具有預(yù)防作用,而對(duì)已經(jīng)發(fā)生關(guān)節(jié)炎的PWH,提高凝血因子水平難以延緩病情進(jìn)展,需采用骨科手術(shù)治療[3]。目前,亟需尋求一種新的有效方法來(lái)延緩HA病情進(jìn)展。干細(xì)胞是具有多向分化潛能的細(xì)胞,在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。近年來(lái),有關(guān)干細(xì)胞療法治療HA的研究[4-6]取得了顯著成果,并已證明此療法可以修復(fù)骨與軟骨缺損,延緩HA病情進(jìn)展。本文就干細(xì)胞療法在HA治療中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。
目前,用于治療HA的干細(xì)胞類型主要包括造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cell,HSC)與間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)。HSC是血液系統(tǒng)中具有長(zhǎng)期自我更新能力和分化成各類成熟血細(xì)胞潛能的成體干細(xì)胞。HSC作為基因載體細(xì)胞,可以用于HA的基因治療。MSC是源于中胚層的具有自我更新和分化潛能的多能祖細(xì)胞,其來(lái)源豐富,可從骨髓、脂肪、臍帶、軟骨等中分離獲取。MSC關(guān)節(jié)腔內(nèi)移植法在骨關(guān)節(jié)炎等疾病的治療中已被證明具有修復(fù)軟骨和延緩病情進(jìn)展的作用,但目前臨床上尚無(wú)MSC關(guān)節(jié)腔移植治療HA的報(bào)道。有研究[4,7]表明,MSC關(guān)節(jié)腔移植能有效減少關(guān)節(jié)腔內(nèi)出血、促進(jìn)骨與軟骨修復(fù)、延緩關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)展,可成為治療HA的有效方法。
2.1 基于HSC的基因治療的優(yōu)勢(shì)將能正常表達(dá)凝血因子基因的病毒載體在體外轉(zhuǎn)導(dǎo)至靶細(xì)胞,再輸入患者體內(nèi)的方法,稱之為間接基因治療法。隨著研究的不斷深入,許多體細(xì)胞被用于HA的基因治療,如成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等,但仍存在細(xì)胞活力喪失、難以持續(xù)表達(dá)等問題[8]。基于HSC的靶向血小板表達(dá)凝血因子Ⅷ的基因治療是目前最具潛力的治療策略[9]。將能正常表達(dá)凝血因子Ⅷ的基因通過(guò)慢病毒載體或CRISPR/Cas9、TALEN等基因編輯工程技術(shù)[10]轉(zhuǎn)導(dǎo)至HSC,在體外富集增殖后,再將其注入患者體內(nèi),HSC將分化形成包含血小板在內(nèi)的血細(xì)胞,在巨核細(xì)胞和血小板特異的啟動(dòng)子控制下,凝血因子Ⅷ特異性表達(dá)并儲(chǔ)存于血小板中,從而實(shí)現(xiàn)治愈HA的目的?;贖SC的基因治療相較于直接輸注病毒載體及其他體細(xì)胞基因治療具有以下優(yōu)勢(shì):①凝血因子替代治療與一般基因治療的凝血因子均表達(dá)于血漿中,因此對(duì)于臨床上存在中和抗體的患者,這2項(xiàng)治療均不能取得良好的效果;而基于HSC的基因治療,在巨核細(xì)胞和血小板特異性啟動(dòng)子(包括GPαIIb啟動(dòng)子、GPαIb啟動(dòng)子、血小板因子4啟動(dòng)子)的控制下,凝血因子Ⅷ特異性表達(dá)并儲(chǔ)存于血小板α顆粒中,減少了其在血液循環(huán)中的暴露時(shí)間,避免受到中和抗體的抑制作用,對(duì)于存在中和抗體的患者同樣有效。②血小板可在表達(dá)凝血因子Ⅷ的同時(shí)表達(dá)血管性血友病因子(von willebrand factor,VWF),二者結(jié)合形成VWF和凝血因子Ⅷ復(fù)合物,并與血管內(nèi)皮膠原進(jìn)一步結(jié)合,提高血栓穩(wěn)定性。③HSC持續(xù)表達(dá)凝血因子Ⅷ的能力更強(qiáng)。王大威[11]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),往小鼠體內(nèi)注射的HSC可參與造血系統(tǒng)的發(fā)育,持續(xù)表達(dá)凝血因子Ⅷ,甚至在二次移植后仍能保持這一能力。
2.2 基于HSC的基因治療的安全性基于HSC的基因治療的安全性是目前的熱點(diǎn)問題。首先,體外基因編輯及細(xì)胞培養(yǎng)增殖過(guò)程中由于基因突變及拷貝數(shù)變異等問題[12],存在發(fā)生基因組改變的風(fēng)險(xiǎn),且在后續(xù)治療中存在致癌的危險(xiǎn)。盡管許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)通過(guò)HSC基因治療后存在致癌現(xiàn)象,但這一問題仍應(yīng)引起重視。其次,以胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)為來(lái)源誘導(dǎo)分化為HSC的過(guò)程中,因在體外難以模擬生理狀況下HSC分化的微環(huán)境[13],所以很難實(shí)現(xiàn)HSC準(zhǔn)確定向分化。王大威[11]通過(guò)iPSC體內(nèi)分化畸胎瘤細(xì)胞的方法分化形成以髓系及淋系終末造血細(xì)胞為終點(diǎn)的HSC。但由于體內(nèi)分化存在不可控性以及畸胎瘤本身的類癌風(fēng)險(xiǎn)性,靶向血小板的基因治療在臨床上應(yīng)用面臨巨大挑戰(zhàn)。對(duì)于老年P(guān)WH,在動(dòng)脈粥樣硬化等風(fēng)險(xiǎn)增大的前提下,靶向血小板表達(dá)凝血因子Ⅷ的基因治療是否會(huì)增加老年P(guān)WH血栓形成風(fēng)險(xiǎn)仍不明確[14]。為了評(píng)估靶向血小板的基因治療的安全性,Baumgartner等[15]建立了高于凝血因子最低治療量30倍的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,并評(píng)估了與血栓形成相關(guān)的各項(xiàng)參數(shù),結(jié)果顯示血小板高濃度表達(dá)凝血因子Ⅷ增加轉(zhuǎn)基因小鼠血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。今后仍需更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證基于HSC的基因治療的安全性。
2.3 基于HSC的基因治療存在的問題血友病作為單基因缺陷疾病是基因治療的首選疾病之一。Nathwani等[16]通過(guò)對(duì)血友病B患者靜脈注射能夠表達(dá)凝血因子Ⅸ的腺相關(guān)病毒載體8(adeno associated virus,AAV8),成功地進(jìn)行了血友病B基因治療的Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究。但是,通過(guò)直接注射病毒載體的方式仍存在許多問題。首先,AAV8病毒載體表達(dá)的凝血因子于血液循環(huán)中,若PWH存在中和抗體,難以避免受到中和抗體的抑制作用[17]。其次,大部分PWH因長(zhǎng)期輸血或使用血液制品,存在感染肝炎病毒或HIV病毒的風(fēng)險(xiǎn),易導(dǎo)致基因治療失敗。此外,在凝血因子Ⅷ或Ⅸ基因成功導(dǎo)入肝細(xì)胞后常伴隨谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)升高隨即凝血因子表達(dá)下降的情況,難以實(shí)現(xiàn)基因持續(xù)表達(dá)[16]。以往由于凝血因子Ⅷ基因過(guò)于龐大(編碼區(qū)長(zhǎng)度約為7.0 kb,超過(guò)了插入AAV的允許范圍),且全長(zhǎng)凝血因子Ⅷ蛋白的細(xì)胞表達(dá)率較差等原因,血友病A的基因治療被認(rèn)為比血友病B更具挑戰(zhàn)性。Valoctocogene roxaparvovec療法又名BMN270療法,是一種使用AAV5病毒載體遞送表達(dá)凝血因子Ⅷ基因的創(chuàng)新基因療法,該療法的出現(xiàn)給血友病A患者帶來(lái)新希望。BMN270是一種無(wú)復(fù)制能力的AAV5基因載體,包括位于其5'和3'末端的雙鏈反向末端重復(fù)序列,以及編碼雜合人類肝臟特異性啟動(dòng)子的單鏈DNA、B結(jié)構(gòu)域缺失的人凝血因子Ⅷ cDNA和合成型聚腺苷酸化信號(hào)[18-19]。ALT升高是BMN270基因療法最常見的不良反應(yīng),需使用激素加以控制。此外,BMN270基因療法對(duì)于存在凝血因子Ⅷ抑制物病史患者的療效仍不確切。目前,BMN270基因療法的基礎(chǔ)研究仍存在較多局限性,需要更多的臨床研究以驗(yàn)證其長(zhǎng)期療效及安全性[20]。
對(duì)于已發(fā)生關(guān)節(jié)病變的PWH,雖然基因治療可以提高患者凝血因子水平,避免自發(fā)性出血,但是難以遏制關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展[21]。鑒于此,Kashiwakura等[22]提出了基于MSC的細(xì)胞治療。基于MSC的細(xì)胞治療已經(jīng)在骨關(guān)節(jié)炎的治療中取得了顯著成效[23]。HA與骨關(guān)節(jié)炎在病理機(jī)制上存在相似性,且大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[4,6,22]也證實(shí)了基于MSC的細(xì)胞治療對(duì)HA有相當(dāng)?shù)寞熜А?/p>
3.1 基于MSC的細(xì)胞治療的作用機(jī)制與骨關(guān)節(jié)炎的細(xì)胞治療不同,HA的細(xì)胞治療需將表達(dá)正常凝血因子Ⅷ和Ⅸ基因的病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至MSC,體外富集增殖后再輸入患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)。從HA的發(fā)病機(jī)制出發(fā),HA治療的潛在目標(biāo)包括含鐵血黃素清除、炎癥消除、血管重塑及骨與軟骨修復(fù)[24]。基于MSC的細(xì)胞治療機(jī)制與HA治療的潛在目標(biāo)有著較高的契合度,主要包括止血、免疫調(diào)節(jié)及骨與軟骨修復(fù)。
3.1.1止血 HA發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵在于關(guān)節(jié)腔內(nèi)反復(fù)出血,而出血產(chǎn)生的含鐵血黃素將沉積于滑膜并引起炎癥,F(xiàn)e2+刺激滑膜薄層轉(zhuǎn)化為肥大的絨毛膜。由于炎癥與增生滑膜的需氧量增加,刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá),導(dǎo)致滑膜新生血管形成,而新生血管更容易受到損傷而引發(fā)出血。因此,出血-增生滑膜-新生血管這一惡性循環(huán)是加劇HA進(jìn)展的主要原因?;贛SC的細(xì)胞治療有望打破這一惡性循環(huán),因?yàn)镸SC在關(guān)節(jié)腔內(nèi)呈高濃度,當(dāng)出血發(fā)生時(shí),高濃度的凝血因子被及時(shí)釋放而用于止血,在血漿凝血因子Ⅷ水平未增加的情況下,基于MSC的細(xì)胞治療仍能有效進(jìn)行止血。與凝血因子替代治療相比,MSC移植治療的優(yōu)勢(shì)是持續(xù)地產(chǎn)生凝血因子而非突然地大量增加凝血因子,這也有利于避免凝血因子抗體的產(chǎn)生。
3.1.2免疫調(diào)節(jié) 免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制包括分泌免疫抑制性細(xì)胞因子配體和受體以及直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[25]。首先,炎癥因子干擾素γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α和白介素( interleukin,IL)1β等能刺激MSC表達(dá)免疫抑制劑、程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death Ligand 1,PD-L1)和PD-L2以及下調(diào)免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物受體,從而抑制炎癥反應(yīng)[26]。其次,MSC還可通過(guò)其表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)因子來(lái)調(diào)節(jié)多種類型的免疫細(xì)胞,從而達(dá)到抗炎的目的。MSC不僅抑制高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白CD34和HSC的單核細(xì)胞分化[27],還可以通過(guò)吲哚胺2,3-二加氧酶、CC基序配體18和前列腺素E2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從促炎切換到抗炎[28],表達(dá)高水平的免疫抑制因子(如IL-10)和低水平的免疫激活劑(如IL-6,IL-12,TNF-α ,IL-1β,IL-23,CD86)?;罨腗SC分泌免疫抑制蛋白TNF-α刺激基因6(TNF-α stimulated gene 6,TSG-6),并抑制新分化的巨噬細(xì)胞的活化。TSG-6與巨噬細(xì)胞上表達(dá)的CD44相互作用并減少核因子-κB的核易位[29]。此外,MSC可以根據(jù)微環(huán)境,釋放抑制因子、刺激因子或表達(dá)其他表面分子,抑制B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等活性,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能,從而降低炎癥反應(yīng)。
3.1.3骨與軟骨修復(fù) MSC的分化作用與旁分泌作用是骨與軟骨修復(fù)的主要作用機(jī)制。MSC微環(huán)境在其中起到了重要作用,主要指分子及細(xì)胞層面的基質(zhì)細(xì)胞、微循環(huán)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多方面多層次組成的MSC生存環(huán)境[30]。HA的病情進(jìn)展與骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)破壞有著密切關(guān)系,而MSC所具有的成骨、成軟骨分化能力有助于骨質(zhì)疏松和骨質(zhì)破壞的改善。在MSC的成骨、成軟骨分化過(guò)程中微環(huán)境起到了決定性作用。在MSC的成骨分化機(jī)制中,BMP信號(hào)通路、Wnt 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、整合素家族、非編碼RNA 包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA、微小 RNA和環(huán)狀 RNA均起著重要作用[28]。此外,微環(huán)境產(chǎn)生的空間邊界條件因素對(duì)成骨分化也具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在直徑為100 μm和150 μm空間邊界條件下培養(yǎng)的MSC具有更強(qiáng)的成骨分化能力[31]。MSC的成軟骨分化,除受Wnt 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路等調(diào)控外,還受到包括Sox家族的Sox9、T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族的Brachyury、C-myc、ERG和Runx2等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。因此,對(duì)下游信號(hào)通路及轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控是促進(jìn)MSC成骨、成軟骨分化的關(guān)鍵。
既往學(xué)者們認(rèn)為,MSC是通過(guò)分化骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞進(jìn)而替代原有損傷組織來(lái)修復(fù)骨與軟骨缺損的。但是,近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),MSC是通過(guò)旁分泌作用特別是外泌體調(diào)節(jié)微環(huán)境來(lái)促進(jìn)其自身修復(fù)的[32-33],而非簡(jiǎn)單地進(jìn)行新舊細(xì)胞的更替。外泌體通過(guò)對(duì)多條信號(hào)通路及細(xì)胞因子的調(diào)控(如蛋白激酶B、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、Wnt信號(hào)通路、微小RNA等)來(lái)抑制軟骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)損傷軟骨細(xì)胞修復(fù)及促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。
3.2 基于MSC的細(xì)胞治療存在的問題理想的基于MSC的細(xì)胞治療應(yīng)為移植后的MSC能長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)凝血因子,然而多項(xiàng)已經(jīng)通過(guò)移植MSC治療成功提高了凝血因子水平的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均未能實(shí)現(xiàn)凝血因子的長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá),其原因可能為細(xì)胞生存能力喪失或出現(xiàn)了抑制抗體[34]。由于很難實(shí)現(xiàn)凝血因子長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)這一理想目標(biāo),HA患者可能需要定期地進(jìn)行MSC移植治療,這無(wú)疑是對(duì)關(guān)節(jié)的重復(fù)損傷,并且還增加了感染的風(fēng)險(xiǎn)。此外,Kashiwakura等[4]的研究結(jié)果表明,能表達(dá)凝血因子Ⅷ的MSC移植治療會(huì)導(dǎo)致凝血因子Ⅷ抗體滴度升高,這意味著此項(xiàng)治療可能會(huì)增加PWH凝血因子Ⅷ抗體滴度。今后仍需進(jìn)行更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證基于MSC的細(xì)胞治療的安全性。
基于干細(xì)胞的基因治療與細(xì)胞治療為HA的治療提供了新的思路。腺相關(guān)病毒載體(AAV5、AAV8)介導(dǎo)的基因治療已經(jīng)在臨床上取得一定的成果,但存在受抑制物影響、ALT升高及凝血因子難以持續(xù)表達(dá)等問題?;贖SC的靶向血小板基因治療有望突破這些局限,但仍難以逆轉(zhuǎn)HA的進(jìn)展?;贛SC的細(xì)胞治療或?qū)⒊蔀镠A的主流治療方法,因其可以有效止血并通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)骨與軟骨修復(fù)等機(jī)制延緩甚至逆轉(zhuǎn)HA的進(jìn)展。目前,基于MSC的細(xì)胞治療仍未應(yīng)用于HA的臨床治療,因此其注射方式、劑量、優(yōu)化療效途徑及安全性問題是今后亟需解決的問題。