尹利端 劉楚怡 仲米存 王長(zhǎng)偉 杜芬 李八方

摘要 [目的]建立視網(wǎng)膜光損傷小鼠動(dòng)物模型，通過(guò)該動(dòng)物模型評(píng)價(jià)藍(lán)莓提取物對(duì)視網(wǎng)膜光損傷小鼠的保護(hù)作用。[方法]綜合評(píng)價(jià)不同劑量藍(lán)莓提取物對(duì)視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響，以及對(duì)視網(wǎng)膜MDA含量，LDH、SOD、CAT和GSH-Px活性的影響。[結(jié)果]藍(lán)莓提取物對(duì)視網(wǎng)膜光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織有顯著的改善作用;藍(lán)莓提取物能夠顯著抑制小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中LDH活性，能夠顯著抑制視網(wǎng)膜內(nèi)部的脂質(zhì)過(guò)氧化，還能夠顯著提高SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶的活性。[結(jié)論]藍(lán)莓提取物對(duì)保護(hù)小鼠視網(wǎng)膜光損傷具有顯著作用。

關(guān)鍵詞 視網(wǎng)膜光損傷;藍(lán)莓提取物;保護(hù)作用;抗氧化活性

中圖分類號(hào) R 285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）05-0178-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.05.050

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Protective Effect of Blueberry Extract on Light-induced Retinal Damage in Mice

YIN Li-duan1，LIU Chu-yi2，3，ZHONG Mi-cun1 et al

（1.Yantai New Era Health Industry Chemical Co.，Ltd.，Yantai，Shandong 264006;2.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao，Qingdao，Shandong 266001;3.Ocean University of China，Qingdao，Shandong 266073）

Abstract [Objective] To establish an animal model of retinal light-damaged mice，and evaluate the protective effect of blueberry extract on retinal light-damaged mice through this animal model.[Method] The effects of different doses of blueberry extract on the structure of retinal tissue，as well as on the content of retinal malondialdehyde （MDA），LDH，SOD，CAT and GSH-Px enzyme activity were comprehensively evaluated.[Result]Blueberry extract could significantly improve the retinal tissue of retinal photodamaged mice.Blueberry extract could significantly inhibit the activity of lactate dehydrogenase enzyme in mouse retinal cells，could significantly inhibit lipid peroxidation inside the retina，and could also significantly increase the activity of antioxidant enzymes such as SOD，CAT and GSH-Px.[Conclusion]Blueberry extract has a significant effect on protecting the retina from light damage in mice.

Key words Light-induced retinal damage;Blueberry extract;Protective effect;Antioxidant activity

藍(lán)莓又被稱為藍(lán)漿果、越橘，其果實(shí)中含有豐富的活性物質(zhì)，包括多糖、酚類以及以糖苷的形式存在的花青素等。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓花青素具有抗過(guò)敏、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、保護(hù)視力等藥理作用，安全無(wú)毒，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥品、保健、食品等領(lǐng)域[1-2]。近年來(lái)，隨著科技的高速發(fā)展，電子光學(xué)照明設(shè)備、手機(jī)電腦等電子產(chǎn)品以及光學(xué)診療等設(shè)備被廣泛應(yīng)用于人們的生活中，也使得視網(wǎng)膜光損傷這一問(wèn)題逐漸引起了人們的重視[3-4]。視網(wǎng)膜光損傷（light-induced retinal damage ，LIRD），是指當(dāng)視網(wǎng)膜受到過(guò)強(qiáng)光照或者過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的光刺激時(shí)，使得部分或全層的視網(wǎng)膜組織受損，造成難以恢復(fù)的視力損害，甚至永久性失明[5]。視網(wǎng)膜光損傷的致病因素可分為光致熱損傷、光致機(jī)械損傷和光致化學(xué)損傷[6]。其中，光致化學(xué)損傷是最主要且最普遍的類型。雖然人的角膜、眼房水、晶狀體可以吸收大部分近紫外光，對(duì)其進(jìn)入視網(wǎng)膜產(chǎn)生阻礙，但長(zhǎng)時(shí)間的短波可見(jiàn)光照射，特別是藍(lán)光波段的照射，仍會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷。短波可見(jiàn)光能夠透過(guò)屈光間質(zhì)到達(dá)視網(wǎng)膜，誘發(fā)視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生自由基，參與脂質(zhì)過(guò)氧化作用，引起視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞萎縮，致使光感受器細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜色素變性、老年視網(wǎng)膜黃斑變性等一系列眼部疾病[7-9]。

視網(wǎng)膜光損傷的病理過(guò)程主要是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡[10]。大量自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體損害、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、細(xì)胞色素氧化酶抑制、視紫紅質(zhì)作用等都可能參與光損傷視網(wǎng)膜的過(guò)程，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡和減少，損傷視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和視功能[11-12]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，外源性抗氧化劑對(duì)光損傷后視網(wǎng)膜具有一定的保護(hù)作用[13]。因此，筆者利用強(qiáng)藍(lán)光照射的方法[14]，建立小鼠的視網(wǎng)膜光損傷動(dòng)物模型，并在此模型的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)藍(lán)莓提取物對(duì)視網(wǎng)膜光損傷小鼠的視網(wǎng)膜的影響，初步探討其對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓提取物（blueberry extract，BE），山東煙臺(tái)新時(shí)代健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供;DPPH檢測(cè)試劑盒、羥自由基（OH）檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒及丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒，南寧建成生物工程有限公司;無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、三氯乙酸、甲醛、甘油等常用試劑均為分析純。UV-2010PC紫外分光光度計(jì)，尤尼克（上海）儀器有限公司;熒光顯微鏡，奧林巴斯Olympus公司;SPF級(jí)Balb/c小鼠，山東朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 藍(lán)莓提取物的制備

取速凍藍(lán)莓果，于室溫下避光解凍，準(zhǔn)確稱取50 g，按照1∶20（m∶V）比例加入提取液，勻漿，于45 ℃水浴浸泡4 h后，超聲波輔助提取30 min，超聲功率為300 W，提取溫度為45 ℃，在3 600 r/min離心15 min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，真空冷凍干燥得藍(lán)莓提取物。

1.3 動(dòng)物試驗(yàn)過(guò)程

選擇SPF級(jí)Balb/c小鼠50只，雌雄各半，平均體重（20±2）g。隨機(jī)分為5組試驗(yàn)組，分別為正常對(duì)照組、視網(wǎng)膜光損傷模型組、BE低劑量組、BE中劑量組和BE高劑量組，每組5只雌性、5只雄性，雌雄分籠飼養(yǎng)。分別按照各組對(duì)應(yīng)樣品和計(jì)量灌胃，灌服的劑量分別為人體推薦用量的5、10和30倍，正常對(duì)照組和模型組灌胃受試物對(duì)應(yīng)溶劑，連續(xù)16 d后，開(kāi)始光損傷試驗(yàn)。光損傷試驗(yàn)：在自制光照箱中安裝2個(gè)32 W的藍(lán)光燈管[13]，使光照箱中心向各方向平均光強(qiáng)度為（5 000±200） lx，溫度24～28 ℃。光照前暗適應(yīng)24 h，接著將除正常組外其他各組給予1%阿托品滴眼散瞳，之后即刻放入光照箱進(jìn)行12 h持續(xù)光照，光照完畢立即進(jìn)入暗箱12 h，如此重復(fù)3次，累計(jì)光損傷36 h。光損傷試驗(yàn)過(guò)程中仍然持續(xù)每日灌胃，累計(jì)灌胃21 d。最后一次光損傷周期完成暗環(huán)境48 h后，斷頸處死，取眼球待用。

1.4 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察

視網(wǎng)膜組織光損傷會(huì)使視網(wǎng)膜組織形態(tài)發(fā)生變化，該組織形態(tài)學(xué)觀察，可觀察到各劑量BE組對(duì)視網(wǎng)膜組織微觀結(jié)構(gòu)的影響。組織取材后，經(jīng)PBS清洗，多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋連續(xù)切片后，進(jìn)行HE染色，用于光鏡檢測(cè)，觀察各組視網(wǎng)膜組織形態(tài)，測(cè)量視網(wǎng)膜石蠟切片外核層厚度，測(cè)量位置為距視神經(jīng) 240 μm、視網(wǎng)膜損傷最重處。

1.5 光損傷動(dòng)物視網(wǎng)膜蛋白含量及抗氧化性指標(biāo)的測(cè)定

冰浴條件下摘取眼球，沿赤道部剖開(kāi)，去除眼前節(jié)，剝離視網(wǎng)膜組織，準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量，以0.1%TBS冷緩沖液為勻漿介質(zhì)，用組織勻裝機(jī)制成10%組織勻漿后，離心取上清，BCA法測(cè)定眼球組織中總蛋白含量，并按照南京建成的MDA檢測(cè)試劑盒、LDH活力檢測(cè)試劑盒、SOD活力檢測(cè)試劑盒、GSH-Px活力檢測(cè)試劑盒和CAT活力檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別測(cè)定視網(wǎng)膜中MDA含量、LDH活力、SOD活力、GSH-Px活力和CAT活力，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用 Microsoft Office Excel 2003 進(jìn)行繪圖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行，以t 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05 差異性顯著，P<0.01 差異性極顯著。所有數(shù)據(jù)均以±S表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓提取物對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)的影響 觀察視網(wǎng)膜HE染色切片，比較各組視網(wǎng)膜的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)的差異。如圖1所示，正常組的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞層數(shù)及數(shù)量較多，染色均勻飽滿，視網(wǎng)膜各層細(xì)胞分布均勻、排列整齊、細(xì)胞貼合緊湊，層次分界清楚，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)核層及外核層細(xì)胞的形態(tài)圓潤(rùn)飽滿。與正常組相比，模型組的視網(wǎng)膜完整性欠缺，視網(wǎng)膜厚度明顯變薄，外核層和內(nèi)核層的細(xì)胞層數(shù)顯著減少，分布不均、細(xì)胞排列散亂，且細(xì)胞間隙變大，表現(xiàn)出皺縮現(xiàn)象。與模型組相比，各BE劑量組的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)排列更整齊，外核層厚度明顯增加，隨著添加劑量的增大，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次、細(xì)胞整齊度及各層細(xì)胞層數(shù)也隨之增大。與正常組相比，BE中、高劑量組外核層厚度恢復(fù)至正常組水平，但整齊性仍不及正常組?？梢?jiàn)中、高劑量藍(lán)莓提取物對(duì)視光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織有顯著的改善作用。

2.2 藍(lán)莓提取物對(duì)光損傷小鼠眼球外核層厚度的影響

以距視神經(jīng) 240 μm處外核層厚度為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各組小鼠視網(wǎng)膜外核層厚度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。模型組視網(wǎng)膜上外核層厚度僅為正常組的50.1%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組相比，不同劑量組BE的外核層厚度均有不同程度的增加，其中BE高劑量組的小鼠視網(wǎng)膜外核層最高。說(shuō)明BE具有修復(fù)光損傷小鼠視網(wǎng)膜外核層的作用。

2.3 藍(lán)莓提取物對(duì)光損傷小鼠視網(wǎng)膜LDH活性的影響 從表1可以看出，與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜LDH活性顯著升高;與模型組相比，BE不同劑量組的LDH活性顯著降低，且隨著B(niǎo)E灌胃劑量的增加，LDH活性逐漸降低。但各BE組的LDH活性與正常組仍存在顯著差異。說(shuō)明BE對(duì)光損傷視網(wǎng)膜組織LDH活性有顯著的抑制作用。LDH能在氧氣不足的情況下經(jīng)糖酵解催化丙酮酸產(chǎn)生乳酸，而乳酸的過(guò)量堆積對(duì)機(jī)體有一定的毒害作用，引起機(jī)體各組織器官病變。因此，BE可以通過(guò)降低LDH活性來(lái)減緩視網(wǎng)膜組織病變。

2.4 藍(lán)莓提取物對(duì)光損傷小鼠視網(wǎng)膜抗氧化酶系的影響

從表2可以看出，與模型組相比，BE各劑量組的SOD活性均極顯著增加（P<0.01），說(shuō)明3種劑量BE均能夠顯著提高光損傷小鼠視網(wǎng)膜SOD的活性。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著重要作用，可促進(jìn)超氧化物陰離子自由基的歧化反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。有研究報(bào)道，可見(jiàn)光照射能透過(guò)屈光間質(zhì)到達(dá)視網(wǎng)膜，誘發(fā)視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生自由基，并參與脂質(zhì)過(guò)氧化作用[13]。光照可以使細(xì)胞內(nèi)SOD水平下降，而灌胃BE的小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞SOD活性較模型組上升，其原因可能是BE能夠?qū)⒊蹶庪x子自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镺 2和H 2O，清除其毒性，減輕并防止過(guò)氧化，從而達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用。

對(duì)各組視網(wǎng)膜CAT活性的檢測(cè)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜CAT活性極顯著降低;與模型組相比，BE中、高劑量組CAT活性極顯著升高（P<0.01），說(shuō)明其能夠提高光損傷造成的視網(wǎng)膜CAT活性降低，增強(qiáng)抗氧化能力。

GSH-Px是一種在細(xì)胞內(nèi)能清除有害的過(guò)氧化物代謝產(chǎn)物的酶，能夠阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化的連鎖反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。與模型組相比，灌胃21 d中、高劑量BE后，光損傷小鼠視網(wǎng)膜中GSH-Px活性極顯著升高（P <0.01），當(dāng)劑量高于20倍時(shí)，其GSH-Px的活性與正常組無(wú)顯著性差異。說(shuō)明一定劑量BE可促進(jìn)體內(nèi)自由基的清除，幫助機(jī)體維持GSH-Px的活性，從而對(duì)視網(wǎng)膜的結(jié)構(gòu)和功能起到保護(hù)作用。

2.5 藍(lán)莓提取物對(duì)光損傷小鼠視網(wǎng)膜MDA含量的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量的高低間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。測(cè)定各組視網(wǎng)膜光損傷小鼠眼球MDA含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表2），與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜MDA含量極顯著升高 （P<0.01）;與模型組相比，BE各劑量組的視網(wǎng)膜MDA含量均極顯著降低 （P<0.01）。說(shuō)明BE對(duì)小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)部的脂質(zhì)過(guò)氧化具有有效的抑制作用。

3 結(jié)論

該研究分析了藍(lán)莓提取物在保護(hù)視網(wǎng)膜藍(lán)光損傷中的作用。首先制備藍(lán)莓提取物，并建立視網(wǎng)膜藍(lán)光損傷小鼠動(dòng)物模型，進(jìn)而利用該模型發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓提取物可使視網(wǎng)膜光損傷小鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)排列更整齊，外核層厚度明顯增加，對(duì)光損傷視網(wǎng)膜中LDH活性和MDA含量有顯著的抑制作用，且可顯著提高光損傷小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性。綜合以上結(jié)果，藍(lán)莓提取物對(duì)小鼠視網(wǎng)膜光損傷具有明顯的保護(hù)作用。

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