黃 婧，白玲玲，王 婷，蘇 華，王銀娟

（中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京210002）

醋酸氯己定沖洗劑為我院院內(nèi)制劑［南制字（2016）B501008］，具有消毒、防腐作用，用于創(chuàng)面消毒和沖洗傷口。主要成分為雙胍類化合物醋酸氯己定，通過吸附在細菌胞漿膜使細胞內(nèi)容物漏出而起到抑菌和殺菌作用，對革蘭陰性菌和陽性菌均有很強的抑制作用［1-2］。該品種收錄于《中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范（2015年版）》［3］中，曾用名為醋酸洗必泰溶液。根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則0128［4］25-26規(guī)定，沖洗劑需要進行細菌內(nèi)毒素檢查。醋酸氯己定沖洗劑在細菌內(nèi)毒素檢查中存在干擾，用稀釋法無法消除［5］。本研究中采用二價離子補充劑稀釋劑Ⅰ稀釋樣品以消除干擾，建立了醋酸氯己定沖洗劑的細菌內(nèi)毒素檢查方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ET-96型內(nèi)毒素注射用水（BET）細菌內(nèi)毒素檢測儀（天津藥典標準儀器廠）；HG71-A型恒溫干燥箱（北京試驗設備廠）；使用的器具、玻璃量器等均按2015年版《中國藥典（四部）》規(guī)定除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。

1.2 試藥

細菌內(nèi)毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格為每支80 EU，批號為150601-201681）；鱟試劑1［標 示 靈 敏 度（λ）為0.25 EU/mL，批 號 為1803231］，鱟試劑2（λ為0.06 EU/mL，批號分別為1803052，1804180），細菌BET（規(guī)格為每支5 mL，批號為1606160），稀釋劑Ⅰ（規(guī)格為每支4 mL，批號為1803130），均購自安度斯生物有限公司；鱟試劑3（λ為0.25EU/mL，批號為1801230），鱟試劑4（λ為0.06EU/mL，批號分別為1806290，1807241），均購自博康海洋生物有限公司；醋酸氯己定沖洗劑（醫(yī)院制劑，規(guī)格為每瓶500 mL，批號分別為180309，180529，180704）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143［4］154-157細菌內(nèi)毒素檢查法復核鱟試劑標示靈敏度，結(jié)果鱟試劑靈敏度均在［0.5λ，2λ］范圍內(nèi)，符合要求。詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結(jié)果Tab.1 The results of TAL sensitivity test

2.2 細菌內(nèi)毒素限值（L）和最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定

L：參照2015年版《中國藥典(四部)》通則0128沖洗劑項下規(guī)定，每1 mL中含細菌內(nèi)毒素的量應小于0.50 EU［4］25-26。因此，將醋酸氯己定沖洗劑的L控制在0.5 EU/mL內(nèi)。

MVD：目前市售鱟試劑的λ范圍為0.03～0.5 EU/mL，按公式MVD=cL/λ（式中，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑靈敏度的標示值）計算，對應的有效稀釋倍數(shù)為0倍、2倍、4倍、8倍、16倍。結(jié)果顯示，0倍、2倍、4倍稀釋液對鱟試劑凝集反應有干擾，故選擇在16倍有效稀釋范圍內(nèi)對其進行細菌內(nèi)毒素檢測的干擾預試驗。

2.3 干擾預試驗

預試驗1（BET稀釋）：取樣品(批號為180309)，分別用BET稀釋2倍、4倍和8倍，作為供試品陰性對照（NPC）；各稀釋倍數(shù)溶液中分別加入2λ內(nèi)毒素（0.5 EU/mL），作為供試品陽性對照（PPC）。取2個廠家的鱟試劑（λ為0.25 EU/mL）分別與NPC、PPC溶液反應；將鱟試劑設為陽性對照（PC），BET設為陰性對照（NC）分別進行試驗。結(jié)果見表2?？梢?，稀釋的醋酸氯己定沖洗劑對鱟試劑凝集反應均有抑制作用，即供試品均存在干擾。

表2 干擾預試驗1結(jié)果Tab.2 The results of preliminary interference testⅠ

預試驗2（稀釋劑Ⅰ結(jié)合BET稀釋）：用稀釋劑Ⅰ將樣品(批號為180309)稀釋2倍后，再用BET分別稀釋4倍和8倍，作為NPC溶液；各稀釋倍數(shù)溶液中分別加入2λ內(nèi)毒素（0.5 EU/mL），作為PPC溶液。取2個廠家的鱟試劑（λ為0.25 EU/mL）分別與NPC、PPC溶液反應，并按常規(guī)設PC和NC。結(jié)果見表3?？梢姡♂?倍的樣品對鱟試劑凝集反應均無抑制作用，即樣品2倍稀釋液中不存在鱟試劑干擾。

表3 干擾預試驗2結(jié)果Tab.3 The results of preliminary interference testⅡ

2.4 干擾試驗

根據(jù)預試驗結(jié)果，對樣品分別稀釋2倍、4倍、8倍，進行鱟試劑干擾試驗。結(jié)果顯示，2倍、4倍稀釋液中均存在干擾，故選取8倍稀釋液進行試驗。取樣品3批，分別用稀釋劑Ⅰ稀釋2倍后，再用BET稀釋，最終為8倍稀釋液，作為NPC溶液，用8倍稀釋的供試品溶液及BET分別稀釋細菌內(nèi)毒素工作標準品，制成2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的溶液。同時使用2個不同廠家的鱟試劑（λ為0.06 EU/mL），按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法［4］154-157進行干擾試驗，結(jié)果見表4?？梢?，將樣品使用稀釋劑Ⅰ、BET稀釋8倍時，對不同批號的鱟試劑與細胞內(nèi)毒素工作標準品反應均無干擾作用。

2.5 標準建立

取本品，使用稀釋劑Ⅰ對樣品稀釋2倍，再用BET對上述溶液進行稀釋，最終得到稀釋8倍的供試品溶液；取上述供試品溶液及BET分別將細菌內(nèi)毒素工作標準品制成2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的溶液，使用λ為0.06 EU/mL的鱟試劑，根據(jù)2015年版《中國藥典（四部）》通則1143檢測供試品溶液中細菌內(nèi)毒素的含量，每1 mL供試品溶液中細菌內(nèi)毒素含量應小于0.5 EU［4］154-157。

表4 樣品細菌內(nèi)毒素干擾試驗結(jié)果Tab.4 Results of bacterial endotoxin interference test of the samples

2.6 樣品檢測

取λ為0.06 EU/mL的鱟試劑，按本研究中擬建立的細菌內(nèi)毒素檢查方法對3批樣品進行常規(guī)檢查，結(jié)果均呈陽性反應。詳見表5。

表5 樣品細菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.5 The results of bacterial endotoxin test for the samples

3 討論

3.1 細菌內(nèi)毒素檢查方法

細菌內(nèi)毒素檢查方法具有試驗條件要求低、檢測速度快、重復性佳、結(jié)果精準等優(yōu)點［6-7］。在2015年版《中國藥典（四部）》附錄中收載的細菌內(nèi)毒素檢查方法有凝膠法和光度測定法［4］154-157。其中，凝膠法操作簡便，是限量試驗，主要為檢驗機構(gòu)判定供試品L是否合格的檢驗手段；光度測定法是定量試驗，主要用于藥品生產(chǎn)企業(yè)定量測定供試品中含有的L，以提高生產(chǎn)質(zhì)量［8-9］。故本研究中選用凝膠法。

3.2 稀釋溶劑

醋酸氯己定沖洗劑對鱟試劑細菌內(nèi)毒素凝集反應有抑制作用［5］，使用BET稀釋無法消除干擾，而使用稀釋劑Ⅰ作為輔助稀釋，可消除干擾［10］。醋酸氯己定沖洗劑主要成分醋酸氯己定含有醋酸根離子，可能與鱟試劑中的單價和二價離子發(fā)生反應，而鱟試劑中的單價和二價離子是保持靈敏度的必需成分，故直接使用BET稀釋會抑制鱟試劑與內(nèi)毒素的反應能力。本研究中選用的稀釋劑Ⅰ為含有一定濃度的二價離子，可飽和醋酸根離子，維持鱟試劑的正常靈敏度［11］。

為了節(jié)省檢驗成本，本研究中考察了最佳稀釋方法。結(jié)果表明，只要在第一步稀釋樣品時加入稀釋劑Ⅰ稀釋，以后步驟用BET稀釋即可排除干擾。

3.3 稀釋倍數(shù)

預試驗中2倍稀釋即無干擾，但正式干擾試驗中，2倍稀釋及4倍稀釋液中分別加入細菌內(nèi)毒素工作標準品制成1λ，0.5λ，0.25λ的PPC溶液時，與鱟試劑反應均為陰性，故最終選取稀釋倍數(shù)為8倍。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法可用于醋酸氯己定沖洗劑細菌內(nèi)毒素的檢查，為可能導致鱟試劑中單價和二價離子缺失樣品的細菌內(nèi)毒素檢查方法的建立提供參考。