伏東寧，邵 杰

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬連云港市中醫(yī)院，江蘇 連云港222004；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港222001）

兒咳靈糖漿由麻黃、苦杏仁、生石膏、黃芩、鮮竹瀝等15味中藥材制成，是連云港市中醫(yī)院院內(nèi)制劑（批準文號為蘇藥制字Z04000017），具有清肺化痰、止咳平喘功效，用于治療上呼吸道感染和急性支氣管炎引起的咳嗽。目前，缺少工藝指標，無法保證大生產(chǎn)的每批產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定?，F(xiàn)行制劑工藝中苦杏仁采用溫水浸泡24 h后加熱蒸餾，收集蒸餾液。文獻［1-3］報道，沸水提取比常溫浸泡更能提高苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率。本研究中探討了苦杏仁和麻黃等14味藥材提取過程中的主要影響因素，以苦杏仁苷、麻黃堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率和干浸膏得率為指標性成分，優(yōu)化兒咳靈糖漿的制備工藝，為其大生產(chǎn)提供參數(shù)指導(dǎo)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DZTW型調(diào)溫電熱套（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）；FA1104型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，精度為0.1 mg）；AS30600B型超聲波清洗器（功率為600 W，頻率為40 kHz）；Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

麻黃、苦杏仁、黃芩等14味藥材均由連云港和興堂飲片廠提供，經(jīng)連云港康濟大藥房連鎖有限公司吳舟執(zhí)業(yè)藥師鑒定為正品；苦杏仁苷對照品（批號為110820-201303，含量以99.6%計），鹽酸麻黃堿對照品（批號為171241-201508，含量以98.6%計），黃芩苷對照品（批號為110715-201418，含量以99.9%計），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁提取工藝優(yōu)化

2.1.1 正交試驗設(shè)計［4］

本試驗在提取2次的前提下，將藥材煎煮方法（因素A）、加水量（因素B）和提取時間（因素C）作為考察因素，在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，每個因素確定3個水平。以苦杏仁苷含量的3次平均值為考察指標，采用L9（34）正交試驗。因素水平見表1。

表1 苦杏仁苷L9（34）正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test for amygdalin

2.1.2 苦杏仁苷含量測定［5］

1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：210 nm。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計不低于7 000。在此色譜條件下，陰性對照品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

2)溶液制備

對照品溶液：取苦杏仁苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.402 5 mg的溶液，即得。

供試品溶液：按處方比例稱取苦杏仁50 g，粉碎成粗粉，按表2中設(shè)計水平完成9次試驗，合并每次提取液，濃縮至500 mL，作為試驗用樣品溶液，供含量測定用。精密量取試驗用樣品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀釋，搖勻，定容至100 mL容量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

表2 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of L9（34）orthogonal test

陰性對照品溶液：按照處方工藝，制備不含苦杏仁的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

3)方法學(xué)考察

圖1 苦杏仁高效液相色譜圖1.amygdalinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of Semen Armeniacae Amarum

線性關(guān)系考察：精密吸取2)項下制備的對照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，定容，搖勻，得0.040 25，0.080 5，0.161，0.322，0.402 5 mg/mL系列質(zhì)量濃度的苦杏仁苷對照品溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按1)項下色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得苦杏仁苷對照品溶液的回歸方程Y=0.068X+0.362（r=0.999 0，n=5）。結(jié)果表明，苦杏仁苷質(zhì)量濃度在0.040 25～0.402 5 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取苦杏仁苷對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.402 5 mg/mL）10μL，按1)項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取1號試驗樣品溶液，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時進樣測定。結(jié)果苦杏仁苷峰面積的RSD為1.25%（n=7），表明供試品溶液在室溫（25℃）條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取1號試驗樣品溶液，依法制備供試品溶液6份，按1)項下色譜條件進樣10μL測定，記錄色譜峰。結(jié)果苦杏仁苷峰面積含量的RSD為0.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密吸取1號試驗樣品（苦杏仁苷含量為1.25 mg/mL）9份，各5 mL，按相當于樣品中苦杏仁苷含量50%，100%，150%的比例加入苦杏仁苷對照品，平行制備3份，依法制成系列供試品溶液，按1)項下色譜條件進樣10μL，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果苦杏仁苷的平均加樣回收率為98.90%，RSD為0.97%（n=9）。

2.1.3 苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率計算及工藝驗證

精密吸取各供試品溶液10μL，按1)項下色譜條件進樣測定，每個樣品平行測定3次，計算轉(zhuǎn)移率?？嘈尤受辙D(zhuǎn)移率=(供試品中苦杏仁苷總量/原藥材中苦杏仁苷總量)×100%。結(jié)果見表2。由表3可見，因素A對試驗有顯著影響（P＜0.01），因素B、因素C對試驗結(jié)果無顯著影響，各因素對苦杏仁苷含量的影響效果大小順序為A＞C＞B。最佳提取工藝為A3B1C2，即苦杏仁沸水入藥，加6倍量水，煎煮2次，每次1 h。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Rusults of ANOVA

2.2 麻黃、黃芪提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗設(shè)計

本試驗將加水量(因素A)、提取時間(因素B)和提取次數(shù)(因素C)作為考察因素，在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，每個因素確定3個水平。以鹽酸麻黃堿、黃芩苷含量的3次平均值為考察指標，采用L9(34)正交試驗。因素水平見表4。

表4 鹽酸麻黃堿、黃芩苷L9（34）正交試驗因素水平表Tab.4 Factors and levels of L9（34）orthogonal test for ephedrine hydrochloride and baicalin

2.2.2 鹽酸麻黃堿含量測定

1)色譜條件［6］與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（3∶97，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：210 nm。理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿峰計不低于3 000。在此色譜條件下，陰性對照品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾。色譜圖見圖2。

2)溶液制備

對照品溶液：取鹽酸麻黃堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.520 mg的溶液，即得。

供試品溶液：將2.1.1項下苦杏仁沸水提取過濾后的藥渣，按處方比例投入麻黃等13味藥材中加水提取，合并煎液，濾過，靜置，取上清液濃縮至500 mL，作為試驗用樣品溶液，供含量測定用。精密量取試驗用樣品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀釋，搖勻，定容至10 mL容量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按照處方工藝，制備不含麻黃的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

3）方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2）項下鹽酸麻黃堿對照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，搖勻，制成系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。吸取上述溶液各10μL注入高效液相色譜儀，按1)項下色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得鹽酸麻黃堿對照品溶液的回歸方程Y=0.299X+0.205（r=0.999 4，n=5）。結(jié)果鹽酸麻黃堿進樣量在0.520～5.200μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取鹽酸麻黃堿對照品溶液10μL，按1）項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為0.88%（n=6），表明儀器精密度良好。

圖2 麻黃高效液相色譜圖1.ephedrine hydrochlorideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of Ephedra sinica

圖3 黃芩高效液相色譜圖1.baicalinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of Scutellaria baicalensis

穩(wěn)定性試驗：取1號試驗樣品溶液10μL，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時進樣測定。結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積的RSD為0.85%（n=7），表明供試品溶液在室溫（25℃）條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：精密吸取1號試驗樣品溶液，依法制備供試品溶液6份，按1）項下色譜條件進樣10μL測定，記錄色譜峰。結(jié)果鹽酸麻黃堿峰面積含量的RSD為1.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密吸取1號試驗樣品（鹽酸麻黃堿含量為2.65 mg/mL）9份，各5 mL，按相當于樣品中鹽酸麻黃堿含量50%，100%，150%的比例加入鹽酸麻黃堿對照品，平行制備3份，依法制成系列供試品溶液，按1）項下色譜條件進樣10μL，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果鹽酸麻黃堿的平均加樣回收率為97.80%，RSD為0.95%（n=9）。

2.2.3 黃芩苷含量測定

1)色譜條件［7］與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計不低于2 500。在此色譜條件下，陰性對照品溶液色譜中，在與供試品溶液色譜相應(yīng)保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，陰性對照無干擾。詳見圖3。

2)溶液制備

對照品溶液：取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.254 mg的溶液，即得。

供試品溶液［8-9］：精密量取“鹽酸麻黃堿”項下試驗用樣品溶液5 mL，蒸干，加甲醇稀釋搖勻，定容至100 mL容量瓶中，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按照處方工藝，制備不含黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

3)方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2)項下制備的對照品溶液1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，定容，搖勻，制成系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按1)項下色譜條件測定。以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標進行線性回歸，得黃芩苷對照品溶液的回歸方程Y=0.024X+0.388（r=0.999 5，n=5）。結(jié)果黃芩苷進樣量在0.254～2.540μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取黃芩苷對照品溶液10μL，按1）項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.32%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取1號試驗樣品溶液，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，16，24 h時進樣測定。結(jié)果黃芩苷峰面積的RSD為1.56%（n=7），表明供試品溶液在室溫（25℃）條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取1號試驗樣品溶液，依法制備供試品溶液6份，按1）項下色譜條件進樣10μL測定，記錄色譜峰。結(jié)果黃芩苷峰面積含量的RSD為1.67%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密吸取1號試驗樣品（黃芩苷含量為8.74 mg/mL）9份，各5 mL，按相當于樣品中黃芩苷含量50%，100%，150%的比例加入黃芩苷對照品，平行制備3份，依法制成系列供試品溶液，按1）項下色譜條件進樣10μL，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果黃芩苷的平均加樣回收率為92.60%，RSD為1.45%（n=9）。

2.2.4 干浸膏得率測定

取正交試驗表中樣品溶液，過濾，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱定質(zhì)量，計算干浸膏得率。

2.2.5 正交試驗設(shè)計及結(jié)果［10-11］

根據(jù)兒咳靈糖漿制備工藝，將2.1.1項下苦杏仁沸水提取過濾后的藥渣，按處方比例投入麻黃等13味藥材中加水提取。以鹽酸麻黃堿轉(zhuǎn)移率、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和干浸膏得率為指標，采用L9（34）正交試驗，對加水量、提取時間和提取次數(shù)進行考察。在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，確定每個因素的3個水平，設(shè)計生成9次試驗，每個試驗重復(fù)3次。試驗設(shè)計與結(jié)果見表5。可見，A因素對3種考察指標的影響最大。根據(jù)表6中各指標下最佳工藝水平組合，選擇2個或2個以上的相同因素和水平作為優(yōu)選工藝，得出最佳優(yōu)選工藝為A3B1C2，即苦杏仁藥渣與麻黃等13味藥材加10倍量水，煎煮2次，每次1 h。

表5 L9（34）正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.5 Design and results of L9（34）orthogonal test

2.3 驗證試驗

稱取10倍處方量藥材，按2.1.1項下苦杏仁沸水入藥提取最佳工藝條件重復(fù)制備3批，過濾，濾液備用；藥渣和麻黃等其他13味藥材按2.2.5項下最佳工藝條件重復(fù)制備3批，過濾，合并濾液。對苦杏仁苷、鹽酸麻黃堿、黃芩苷的轉(zhuǎn)移率及干浸膏得率6個指標進行考察。結(jié)果見表7。可見，通過正交試驗得出的最佳工藝較穩(wěn)定，可用于兒咳靈糖漿各藥材的提取。

3 討論

麻黃為方中主藥，具有發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫作用，其主要有效成分為麻黃堿；苦杏仁有效成分為苦杏仁苷，具有鎮(zhèn)咳平喘作用；黃芩主要有效成分為黃芩苷，具有清熱解毒功效［12］。故采用麻黃堿、苦杏仁苷和黃芩苷3個有效成分作為考察指標對兒咳靈糖漿提取工藝進行優(yōu)化。

表6 各因素對考察指標的影響分析結(jié)果（%）Tab.6 The influence of various factors on the inspection indicators（%）

表7 工藝驗證試驗結(jié)果Tab.7 Results of the verification tests

2017年，江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局認證審評中心發(fā)布《關(guān)于對平喘止咳糖漿等制劑品種質(zhì)量標準提高相關(guān)事項的函》(藥事便函〔2017〕117號)，公布兒咳靈糖漿的制備工藝為苦杏仁50 g，溫水浸泡24 h，加熱蒸餾，收集蒸餾液50 mL。文獻［13-14］報道，溫水條件下，苦杏仁酶會促進苦杏仁苷水解，降低苦杏仁苷含量。故在不改變原有水提工藝前提下，增加沸水入藥提取和常規(guī)煎煮（即直接加水煎煮提?。，F(xiàn)行版要求苦杏仁是在溫水浸泡加熱蒸餾后，收集蒸餾液，檢測苦杏仁苷的含量；另取藥渣過濾后的濾液檢測苦杏仁苷的含量。結(jié)果2種溶液都能檢測出苦杏仁苷的含量，且含量一致，故正交試驗設(shè)計時收集濾液，不再收集蒸餾液。以苦杏仁苷的含量為指標，比較3種水提方法進行工藝優(yōu)化。預(yù)試驗中分別考察了8，10，12倍加水量對苦杏仁提取效果的影響。結(jié)果表明，加水量增大到12倍，并不能提高苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率。可能是苦杏仁屬種子類藥材，吸水率不高。為節(jié)約成本，正交設(shè)計中加水量因素設(shè)計為6，8，10倍量3個水平。考察了提取次數(shù)對苦杏仁苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果表明，增加提取次數(shù)，并不能提高苦杏仁苷的轉(zhuǎn)移率，故正交設(shè)計中確定為提取2次。