張 蓓，余瀟苓，萬永艷，覃開羽，張洪平，梁學政△

（1.廣西壯族自治區(qū)柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州545026；2.浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州310000）

牛樟樹為樟科植物，原產(chǎn)地為臺灣，生長在海拔450～2 000 m的山林間，因生長在百年以上的樹干腐朽之心材內(nèi)壁的真菌——牛樟芝而得名，被譽為森林中的紅寶石［1］。牛樟芝可抗腫瘤、抗衰老、保護肝臟、增強免疫力等，但生長周期過長，品種珍稀，不利于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展［2-6］。前期試驗結(jié)果表明，牛樟葉水提物含有大量多糖類成分，開展水提物最優(yōu)提取條件研究有一定的研究價值［7-10］。本研究中以多糖為指標性成分，采用星點響應面法優(yōu)選提取方法，以最大程度提取出多糖類成分，為后期進一步優(yōu)化提取方法及多糖的純化試驗奠定基礎。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAP型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為0.1 mg）；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；UV1780-5型紫外分光光度計（島津企業(yè)管理＜中國＞有限公司）；L600型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為240 W，頻率為40 kHz）

1.2 試藥

牛樟葉由廣西柳州市天姿園藝有限公司提供，經(jīng)柳州市中醫(yī)醫(yī)院吳冰副主任藥師鑒定為樟科植物牛樟的葉子；苯酚（批號為10015318），硫酸（批號為10008316），乙醇（批號為10009164），均購自國藥集團化學試劑有限公司；無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110833-201707，規(guī)格為100 mg，純度為≥99%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖含量測定（硫酸-苯酚法）

溶液制備：取牛樟葉5 g，打粉，過60目篩，加250 mL蒸餾水，80℃水浴提取60 min，即得供試品溶液。取無水葡萄糖對照品0.024 8 g，精密稱定，加水定容至250 mL容量瓶中，即得對照品溶液。

顯色：精密量取多糖溶液1.0 mL，置10 mL具塞比色管中，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，精密加入濃硫酸3.0 mL，充分混勻，90℃水浴30 min。另以蒸餾水為空白對照同上操作，于490 nm波長處測定吸光度。

線性關系考察：取對照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置10 mL具塞比色管中，加水至1.0 mL，得系列質(zhì)量濃度為0.01984，0.03968，0.05952，0.07936，0.099 2 mg/mL的葡萄糖對照品溶液，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸3 mL，搖勻，90℃水浴保溫30 min，取出，迅速冷卻至室溫，同法制備空白溶液。照2015年版《中國藥典（四部）》紫外-可見分光光度法（通則0401），在490 nm波長處測定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標、葡萄糖質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，葡萄糖標準溶液的線性回歸方程為Y=5.962 7X+0.033 7，R=0.999 6(n=5）。結(jié)果表明，葡萄糖標準溶液質(zhì)量濃度在0.019 84～0.099 2 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關系良好。

精密度試驗：精密量取對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.255 mg/mL）1.0 mL，連續(xù)進樣測定5次。結(jié)果平均吸光度值為0.313 4，RSD為1.17%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密量取供試品溶液1.0 mL，分別于0，2，4，6，8，12，24 h時測定吸光度，并計算RSD值。結(jié)果平均吸光度值為0.321 4，RSD為1.67%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：平行制備同一批（批號為20190322）牛樟葉多糖提取液6份，依法顯色后測定吸光度，并計算RSD值。結(jié)果樣品中葡萄糖標準溶液吸光度的RSD為0.59%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品0.5 g，精密稱定，共6份，加入20 mg葡萄糖對照品，按最優(yōu)提取工藝提取樣品，并將上述多糖置25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配置多糖溶液，顯色后測定吸光度，并計算回收率和RSD值。結(jié)果見表1。

表1 多糖加樣回收試驗（n=6）Tab.1 Recovery test of polysaccharide（n=6）

2.2 單因素試驗

打粉粒徑：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，共3份，打粉，分別過20，24，40，60目篩，浸漬1 h，水浴溫度為80℃，料液比為1∶50（m/V），考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為9.51，10.29，11.67，15.40 mg/g。可見，打粉粒徑越小，多糖含量越高。

浸漬時間［11］：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，共3份，打粉，過60目篩，水浴溫度為80℃，料液比為1∶50（m/V），分別浸漬30，60，90 min，考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為7.63，10.29，11.15 mg/g?？梢?，浸漬時間越長，多糖含量越高。

水浴溫度：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，共3份，打粉，過60目篩，浸漬1 h，料液比為1∶50（m/V），分別置70，80，90℃恒溫水浴鍋中，考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為9.27，10.29，13.10 mg/g?？梢姡S著水浴溫度的升高，多糖含量升高。

料液比：取牛樟葉1.0 g，精密稱定，打粉，過60目篩，浸漬90 min，水浴溫度為90℃，分別加40倍、50倍、60倍水，即料液比為1∶40（m/V）、1∶50（m/V）、1∶60（m/V），考察牛樟葉可提取多糖含量。結(jié)果牛樟葉可提取多糖含量分別為13.62，10.29，8.94 mg/g。可見，隨著料液比比例的增大，多糖含量降低。

2.3 提取工藝優(yōu)化

提取工藝條件：根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，選取浸漬時間(因素A)、料液比(因素B)、水浴溫度(因素C)為響應面模型的 自 變 量，采 用Design-Expert.v8.0.6軟 件，設 置響應值目標［浸漬時間為30～90 min，料液比為1∶40（m/V）、1∶50（m/V）、1∶60（m/V），水浴溫度最大為100℃］，確定最佳提取工藝。變量因素和水平見表2。根據(jù)響應面試驗，得到的試驗組合與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，通過Design-Expert v8.0.6軟件擬合得到的模型，其水平小于0.05，表明該模型有高度顯著性；失擬項檢驗結(jié)果表明，失擬誤差不顯著（P=0.584 3），表明未知因素對試驗結(jié)果影響很小，預測回歸模型與試驗結(jié)果擬合很好；預測模型的R2=0.996 1，表明多糖含量的試驗值與預測值間的一致性較好；該模型的變異系數(shù)(CV)=4.13%＜5%，校正系數(shù)(R2Adj)=0.991 1，表明預測模型能反映99.11%響應值的變化，故通過回歸方程能預測并分析試驗的真實數(shù)據(jù)。由表4可見，各單因素對牛樟葉多糖含量(Y)影響從大到小依次為B＞C＞A，料液比與提取溫度間的交互影響最顯著。根據(jù)Design-Expert v8.0.6軟件擬合得回歸方程Y=10.33+1.98A-4.39B+4.28C+0.29AB+0.47AC-2.08BC-2.07A2+2.86B2+2.43C2。

表2 變量因素和水平Tab.2 Variable factors and their levels

表3 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Tab.3 Design and results of Box-Behnken experiment

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

響應面圖分析：通過Box-Behnken試驗得到的多元回歸模型所作的響應面圖及等高線見圖1。響應面的曲面越陡峭，表明該因素對響應值的影響越顯著；等高線越密集則影響越顯著，越稀疏則影響越小?？梢?，液料比所對應的曲面最陡峭，提取時間所對應的曲面最平滑，表明液料比對牛樟葉提取多糖含量的影響最顯著，浸漬時間的影響最小。結(jié)果料液比為1∶40（即40倍蒸餾水）、溫度為90℃、浸漬時間為75.61 min時，牛樟葉水提物中多糖提取率最高（26.924 7 mg/g）。

圖1 各影響因素間的交互作用對多糖提取率的響應面圖及等高線圖A.The interaction between soaking time and liquid-material ratio B.The interaction between soaking time and extraction temperature C.The interaction between liquid-material ratio and extraction temperatureFig.1 The response surface diagram and contour diagram of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharide

驗證試驗：取牛樟葉5 g，精密稱定，共3份，按最優(yōu)提取工藝進行驗證試驗，操作方法同前。結(jié)果牛樟葉水提物中多糖含量為26.88 mg/g，與理論預測值26.92 mg/g基本吻合。

3 討論

植物多糖生物活性廣泛，獨特活性和來源的天然性在保障人體健康應用中具有很大潛力［12-16］。但多糖結(jié)構(gòu)復雜，種類繁多，其結(jié)構(gòu)測定和分離純化有一定難度；且在天然植物中含量低，不易分離，這給多糖的研究和應用帶來了許多挑戰(zhàn)。Box-Behnken星點設計響應面法相較于正交試驗設計法和均勻設計法，具有預測性好、精確度高的特點，故本研究中采用單因素試驗與Box-Behnken星點設計響應面法對牛樟葉水提物進行提取工藝優(yōu)化。驗證試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實測值與預測值的相對誤差較小，表明采用響應面法所得優(yōu)化條件穩(wěn)定、可靠。當提取工藝參數(shù)為藥材過60目篩、料液比為1∶40（m/V）、水浴溫度為90℃、浸漬時間為75.61 min時，牛樟葉水提物中可提取的多糖含量最高。