穆艷超，陳新

(安陽(yáng)市婦幼保健院 a.檢驗(yàn)科;b.口腔科，河南 安陽(yáng) 455000)

復(fù)發(fā)性阿弗他口腔炎(recurrent aphthous stomatitis，RAS)是常見(jiàn)的口腔黏膜疾病，具有周期復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。RAS多發(fā)于舌、腭、唇、頰等處，主要表現(xiàn)為圓形、橢圓形、孤立的淺表性潰瘍，可出現(xiàn)顯著的灼燒感，飲食和說(shuō)話(huà)可致疼痛加劇，不適感可影響患者飲食、言語(yǔ)，降低患者生活幸福感[1]。該病是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但因其發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療手段主要以抑制炎癥加重、緩解疼痛、促進(jìn)潰爛愈合、延長(zhǎng)疾病發(fā)作間歇期為目的，尚缺乏有效的治療手段[2]。研究顯示，有超過(guò)1/3的RAS患者具有顯著的遺傳易患性，人類(lèi)白細(xì)胞抗原A2表型與RAS發(fā)生具有顯著相關(guān)性，血凝素基因缺陷患者的RAS發(fā)病率高達(dá)56%，葉酸代謝通路基因表達(dá)異常的人群RAS患病率顯著高于正常人群，細(xì)胞因子基因高表達(dá)的人群中RAS的發(fā)病率高于低表達(dá)人群[3-5]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選候選基因，并驗(yàn)證JAK2、STAT3、IL-6、SOCS3、CXCR4在RAS組織中異常表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年9月至2020年10月安陽(yáng)市婦幼保健院口腔科收治的25例RAS患者，取其病灶組織作為觀(guān)察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病史1 a以上，1 a發(fā)作2次以上；(2)無(wú)其他口腔疾病，就診前3 d內(nèi)未服用抗生素、止痛藥、免疫抑制劑等藥物；(3)年齡15～35歲。選取同期25例拔牙者智齒附著組織為對(duì)照組。對(duì)照組：男12例，女13例；年齡21～35歲，平均(26.9±2.0)歲。觀(guān)察組：男12例，女13例；年齡16～35歲，平均(25.7±2.3)歲。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)安陽(yáng)市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入研究者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理高通量測(cè)序數(shù)據(jù)從National Center for Biotechnology Information(NCBI)Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取，測(cè)序系列號(hào)為GSE37265。該數(shù)據(jù)集中共包含14例RAS患者，分別采集患者的潰瘍組織、正常組織，提取總RNA，按照Affymetrix標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程對(duì)RNA進(jìn)行片段化、端部修復(fù)、連接和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增建庫(kù)，使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3 差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選建立篩選條件：-log10P>-log100.05；|log2Fold Change|>1。log2Fold Change>1為高表達(dá)基因，log2Fold Change<-1為低表達(dá)基因。

1.4 基因富集的分析利用DAVID在線(xiàn)軟件分析DEGs富集情況。DAVID被用于信號(hào)通路Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)的分析。通過(guò)DAVID軟件計(jì)算各富集組的P值。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)取對(duì)照組和觀(guān)察組新鮮組織20 mg放入無(wú)RNA酶的離心管中，加入4 ℃預(yù)冷生理鹽水5 mL，以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min，棄上清。使用4 ℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌，以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min，棄上清。使用核酸提取儀提取總RNA。RNA水平經(jīng)NanoDrop 2000檢測(cè)，OD260/OD280大于1.90可用于后續(xù)試驗(yàn)。用TOYOBO試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR管中加1 μL Random Primer，加3.0 μg提取的mRNA，用RNase Free H2O補(bǔ)齊至20 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-80 ℃保存。使用Roche combas z480進(jìn)行熒光定量PCR，擴(kuò)增引物由上海生工公司合成。反應(yīng)體積為25 μL，ACTB為內(nèi)參基因，每個(gè)基因做3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min，95℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；37 ℃ 1 min。使用2-ΔΔCt法進(jìn)行擴(kuò)增數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中不同組織的DEGs對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并對(duì)對(duì)照組和觀(guān)察組的基因表達(dá)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，共計(jì)1 645個(gè)DEGs滿(mǎn)足篩選條件(-log10P>-log100.05且|log2Fold Change|>1)，其中高表達(dá)1 082個(gè)，低表達(dá)563個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 符合篩選條件的基因倍數(shù)與P值負(fù)對(duì)數(shù)分布圖

2.2 DEGs功能分布情況使用DAVID軟件分析DEGs富集最多的5個(gè)信號(hào)通路為細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、癌癥通路、單純皰疹病毒感染通路。見(jiàn)表1。

表1 GSE37265中DEGs富集的信號(hào)通路情況

2.3 候選基因的篩選情況DEGs導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。在蛋白間相互作用(protein-protein interaction，PPI)關(guān)系網(wǎng)中，39個(gè)基因編碼PPI置信度大于0.995，見(jiàn)表2。39個(gè)基因被篩選為候選基因，用于進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 GSE37265 DEGs編碼蛋白PPI分析

2.4 qPCR驗(yàn)證候選基因結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證，觀(guān)察組JAK2mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，STAT3mRNA、IL-6mRNA、SOCS3mRNA、CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 qPCR驗(yàn)證候選基因mRNA表達(dá)情況

3 討論

RAS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。研究表明，RAS發(fā)病與免疫、遺傳和環(huán)境等多種因素有關(guān)[6]。維生素B12、葉酸、鋅缺乏以及吸煙、精神壓力、激素和月經(jīng)周期變化等都可誘發(fā)RAS[7]。其發(fā)病無(wú)顯著季節(jié)性，具有自限性、復(fù)發(fā)性和周期性等特點(diǎn)，炎癥病灶的潰瘍面積不大，病灶中心位置可見(jiàn)表面覆蓋假膜的凹陷[8]。

以往研究表明，RAS患者外周血中細(xì)胞免疫指標(biāo)CD4、CD4/8、CD16+56水平低于對(duì)照組，血清免疫指標(biāo)IgM、CH50、IL-6水平高于對(duì)照組，提示RAS患者疾病期細(xì)胞免疫功能降低，體液免疫功能發(fā)生紊亂[9]。本研究報(bào)道JAK2、STAT3、IL-6、SOCS3、CXCR4等多個(gè)基因在病灶組織中表達(dá)異常，這與以往其他類(lèi)型炎癥性疾病中發(fā)現(xiàn)的DEGs一致[10]。本研究報(bào)道的異常表達(dá)基因可參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)等多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與機(jī)體免疫功能的調(diào)控密切相關(guān)。RAS表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性炎癥性潰爛，參與炎癥過(guò)程的細(xì)胞因子表達(dá)異?；蛐盘?hào)通路調(diào)節(jié)紊亂都不利于RAS的控制。以往研究發(fā)現(xiàn)，JAK2和STAT3廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞與組織中，是JAK/STAT信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[11]。本研究證實(shí)JAK2mRNA、STAT3mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組有顯著差異，JAK2和STAT3編碼蛋白表達(dá)量變化及其磷酸化程度將對(duì)RAS炎癥過(guò)程產(chǎn)生重要影響，根據(jù)JAK2和STAT3編碼蛋白活化情況調(diào)控其表達(dá)，糾正信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)狀態(tài)將有利于RAS的控制。SOCS3可通過(guò)占據(jù)受體磷酸化酪氨酸位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性阻斷STAT3對(duì)受體的招募；SOCS3可與JAK家族蛋白結(jié)合，特異性抑制JAK激酶活性，且SOCS3及其蛋白家族其他成員可介導(dǎo)JAK家族蛋白泛素化降解，從而抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞與組織正常免疫穩(wěn)態(tài)被打破，產(chǎn)生一系列炎癥相關(guān)疾病[12]。IL-6是由白細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在免疫細(xì)胞中成熟活化，通過(guò)血液運(yùn)輸至靶細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。CXCR4參與JAK2和STAT3磷酸化過(guò)程。藥物調(diào)節(jié)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路有助于緩解炎癥，促進(jìn)受損黏膜的修復(fù)，減輕組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[13]。研究表明，黃芪建中湯具有抑制潰瘍的作用，可能通過(guò)激活JAK2/STAT3通路，調(diào)節(jié)免疫屏障功能[14]。針對(duì)該病的分子靶點(diǎn)藥物尚未開(kāi)發(fā)應(yīng)用，檢測(cè)病灶組織中的分子指標(biāo)或血清標(biāo)志物有助于判斷疾病預(yù)后。目前，對(duì)于RAS的治療仍以抑制炎癥進(jìn)展、緩解疼痛、降低復(fù)發(fā)率、延長(zhǎng)疾病發(fā)作間歇期為目的?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步將有助于RAS的治療和精準(zhǔn)防控，進(jìn)一步闡明RAS疾病進(jìn)展的機(jī)制是精準(zhǔn)治療的前提。炎癥性疾病涉及的信號(hào)通路復(fù)雜，涉及的分子較多，從發(fā)病機(jī)制入手糾正RAS病程中分子網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)將有助于實(shí)現(xiàn)根治目標(biāo)。以往研究提示，糾正細(xì)胞或者組織分子網(wǎng)絡(luò)應(yīng)綜合評(píng)估采取措施的安全性[15]，深入挖掘?qū)τ赗AS進(jìn)展影響大的致病因子是未來(lái)研究的方向。

檢測(cè)RAS相關(guān)基因有望為解釋疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。本研究由于樣本量較小并且未建立動(dòng)物模型，基因表達(dá)差異的調(diào)控機(jī)制尚未得到深入解釋?zhuān)髽颖玖亢蛣?dòng)物模型的建立將有助于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究。