徐元元,王 悅,楊二林,王小超,趙浩安,程 妮,3,曹 煒,3

(1.西北大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 西安 710069;2.西北大學(xué) 化工學(xué)院,陜西 西安 710069;3.陜西省蜂產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心,陜西 西安 710065)

蜂花粉是蜜蜂采集被子植物雄蕊花藥或裸子植物小孢子囊內(nèi)的花粉,形成的團(tuán)粒狀物[1],是自然界營(yíng)養(yǎng)最豐富的天然食品之一。蜂花粉富含糖類、蛋白質(zhì)、游離氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)元素、維生素和酚類化合物等多種生物活性物質(zhì)[2-3]。近年來，研究表明蜂花粉多酚提取物具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗腫瘤,提高機(jī)體免疫能力等生理活性[4-6]。

植物酚類物質(zhì)主要分為可溶性酚類(水有機(jī)相中)和不溶性酚類(殘?jiān)??？扇苄苑宇愇镔|(zhì)以游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)形式存在[7]。不溶性酚類共價(jià)結(jié)合蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)[8],通過酸、堿水解破壞化學(xué)鍵,釋放酚類物質(zhì)。近年來有研究發(fā)現(xiàn),紅棗多酚類物質(zhì)以游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)酚類化合物存在[9],長(zhǎng)黑青稞多酚以可溶性、游離、酯化、醚化和不溶鍵合態(tài)存在[10]。本課題組前期對(duì)東北盛產(chǎn)的槭樹、蒲公英和山里紅蜂花粉的多酚類物質(zhì)的存在形態(tài)進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)蜂花粉的多酚類物質(zhì)主要以游離態(tài)形式存在[11]。油菜、茶花和玫瑰蜂花粉產(chǎn)量豐富,是我國(guó)的大宗蜂花粉,其酚類物質(zhì)的存在形態(tài)未見研究報(bào)道,因此有必要開展這3種蜂花粉的酚類化合物組成及其抗氧化活性研究。

本研究以我國(guó)主產(chǎn)的茶花、玫瑰和油菜蜂花粉為對(duì)象,分析蜂花粉中不同存在形態(tài)的酚類物質(zhì)(游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)、糖苷鍵合態(tài))的組成與含量,DPPH自由基清除能力、Fe2+絡(luò)合能力、Fe3+還原能力和對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)能力等體外抗氧化活性,以明確蜂花粉多酚類物質(zhì)的存在形態(tài)及抗氧化活性,為蜂花粉抗氧化功能食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶花、玫瑰和油菜蜂花粉均產(chǎn)自湖北省,并經(jīng)過了花粉孢子檢驗(yàn)[12-14],確定每種蜂花粉的種類。

沒食子酸、蘆丁、11-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH自由基)、Na2EDTA、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃(Trolox)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、酚類標(biāo)準(zhǔn)品(沒食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、2-4-二羥基苯甲酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、蘆丁、鞣花酸、柚皮素、肉桂酸、山奈酚、槲皮素、異甘草素)均從Sigma公司(美國(guó))購(gòu)買;瓊脂糖購(gòu)于BioWest公司(西班牙);pBR322 DNA從Takara生物技術(shù)公司(日本)購(gòu)買;色譜級(jí)甲醇,過氧化氫(H2O2)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購(gòu)于科昊生物工程有限公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 蜂花粉酚類物質(zhì)的提取

不同存在形態(tài)酚類物質(zhì)的提取采用溶劑萃取和酸堿水解相結(jié)合的方法[9，15-16]。

1.2.1 游離態(tài)酚類物質(zhì)的提取 分別稱取3種花粉20 g,按1∶15(m/V)加75%乙醇,熱回流2 h后離心,保留上清液,沉淀重復(fù)以上操作2次。濃縮上清液,用6 mol/L HCl酸化至pH為2,離心,上清液用2倍體積的正己烷脫脂3次,脫脂后用乙酸乙酯和乙醚(1∶1,V/V)(簡(jiǎn)稱AE/DE)萃取至無色,合并萃取液,用無水硫酸鈉干燥后過濾,真空旋蒸至干,復(fù)溶于5 mL 75%乙醇,置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?標(biāo)記為游離態(tài)酚類物質(zhì)。

1.2.2 酯鍵合態(tài)酚類物質(zhì)的提取 向上述游離態(tài)多酚提取后的剩余物中加入10 mL的NaOH溶液,充入氮?dú)?室溫下堿水解4 h后,用6 mol/L的HCl溶液調(diào)至pH=2,再用AE/DE萃取至無色,合并萃取液,用無水硫酸鈉干燥后過濾,真空旋蒸至干,復(fù)溶于5 mL 75%乙醇,置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?標(biāo)記為酯鍵合態(tài)酚類物質(zhì)。

1.2.3 糖苷鍵合態(tài)酚類物質(zhì)的提取 從酯鍵合態(tài)多酚提取后的水相中加入6 mol/L HCl,85℃下酸化30 min,用AE/DE萃取至無色,合并萃取液,用無水硫酸鈉干燥后過濾,真空旋蒸至干,復(fù)溶于5 mL 75%乙醇,置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?標(biāo)記為糖苷鍵合態(tài)酚類物質(zhì)。

1.2.4 甲醇不溶態(tài)酚類物質(zhì)的提取 取出離心后的固體殘?jiān)? mol/L NaOH在室溫下堿水解4 h,再用6 mol/L HCl酸化至pH為2,離心,棄去濾渣,上清液用2倍體積的正己烷脫脂3次,然后用AE/DE萃取至無色,合并萃取液,用無水硫酸鈉干燥后過濾,真空旋蒸至干,復(fù)溶于5 mL 75%乙醇,置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆?標(biāo)記為甲醇不溶態(tài)酚類物質(zhì)。

1.3 色譜分析

采用高效液相色譜(HPLC-DAD)法測(cè)定蜂花粉酚類化合物含量[17],HPLC-DAD(Agilent Technologies Deutschland,Germany)色譜柱Zorbax SB-C18(250 mm,5.0 μm);流動(dòng)相是甲醇(A)和0.1%甲酸(B);洗脫程序?yàn)?0 min,15% A;0～5 min,17% A;5～10 min,30%A;10～25 min,40% A;25～35 min,50% A;35～40 min,55% A;40～55 min,60% A;55～65 min,65% A;65～70 min,70% A;70～75 min,70% A。流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣量是10 μL,二極管陣列檢測(cè)器(DAD);檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm、280 nm、290 nm、324 nm;柱溫是30℃。配置0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過比對(duì)保留時(shí)間和二維譜圖確定花粉多酚的種類,將HPLC-DAD圖中酚類化合物的峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

1.4 不同存在形態(tài)酚類化合物體外抗氧化活性的測(cè)定

1.4.1 總酚含量測(cè)定 參照Zhou等方法測(cè)定不同花粉提取液的總酚含量[18]。用乙醇將待測(cè)液稀釋10倍,準(zhǔn)確移取1 mL不同待測(cè)稀釋液至10 mL刻度試管中,依次加入1 mL福林酚試劑、5 mL Na2CO3(1 mol/L),蒸餾水定容到10 mL,充分混勻后避光靜置1 h。760 nm測(cè)量吸光度,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g花粉)表示。

1.4.2 總黃酮含量測(cè)定 在Blasa等方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)[19],測(cè)定不同花粉提取液的總黃酮含量。移取1 mL不同花粉提取液至10 mL刻度試管中,加入0.4 mL NaNO2(5%),6 min后加入0.4 mL Al(NO3)3(10%),反應(yīng)6 min后加入4 mL NaOH(4%),加4.2 mL 80%甲醇,振蕩混勻后室溫放置15 min。510 nm測(cè)量吸光度,結(jié)果以蘆丁當(dāng)量(mg RE/g花粉)表示。

1.4.3 Fe2+絡(luò)合力測(cè)定 參照Nandita等方法并稍作修改進(jìn)行測(cè)定[20]。取200 μL不同花粉提取液,依次加入100 μL FeSO4(1 mM)、300 μL Ferrozine(1 mM)、2.4 mL甲醇,混勻靜置10 min。562 nm測(cè)量吸光度,結(jié)果表示為Na2EDTA當(dāng)量(mg Na2EDTA/g花粉)。

1.4.4 Fe3+還原力測(cè)定 參照Benzie等方法測(cè)定不同花粉提取液的鐵離子還原能力[21]。取1 mL的不同花粉提取液,加入4.0 mL的TPTZ工作液(包括300 mM pH=3.6醋酸鹽緩沖液,10 mM TPTZ,20 mM FeCl3,按10∶1∶1配置),37℃水浴10 min。593 nm測(cè)量吸光度,結(jié)果表示為mg Trolox/g花粉。

1.4.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定 對(duì)Thaipong等人的研究方法進(jìn)行改進(jìn)，測(cè)定不同花粉提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力[22]。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的不同花粉提取液,用75%的甲醇定容至1 mL,加入4 mL DPPH(0.04 mg/mL)后避光反應(yīng)1 h。517 nm測(cè)量吸光度,結(jié)果用IC50(清除率是50%時(shí),所需花粉提取液的濃度)表示,DPPH自由基清除率計(jì)算公式

其中：A0為參比溶液的吸光值；A1為反應(yīng)1 h后樣品溶液的吸光值。

1.5 對(duì)·OH誘導(dǎo)的pBR322質(zhì)粒DNA氧化損傷保護(hù)作用的測(cè)定

參照Yeung等方法進(jìn)行測(cè)定[23]。正常組加入0.5 μg DNA和14 μL PBS,模型組加入0.5 μg DNA、1 μL 1 mM FeSO4、1 μL H2O2、12 μL PBS,實(shí)驗(yàn)組是0.5 μg DNA、1 μL 1 mM FeSO4、1 μL H2O2、3 μL不同花粉提取液、9 μL PBS。反應(yīng)液于37℃避光水浴30 min,0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳50 min。使用凝膠成像儀(UVP Gelstudio touch)進(jìn)行拍照,通過Quantity One軟件分析電泳各條帶的光密度,確定DNA雙螺旋與開鏈的百分比,以比較不同花粉提取液對(duì)·OH誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010初步處理數(shù)據(jù),SAS 8.1進(jìn)行方差分析和顯著性分析,Origin 9.0作圖。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,P<0.05代表顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同存在形態(tài)酚類化合物組成

2.1.1 不同存在形態(tài)酚類化合物組成的色譜分析結(jié)果 本研究采用HPLC-DAD對(duì)3種蜂花粉不同存在形態(tài)酚類化合物進(jìn)行鑒定(見圖1),其種類和含量有所不同,結(jié)果見表1。茶花蜂花粉共檢出9種酚類化合物,其中沒食子酸、槲皮素和山奈酚主要存在于游離態(tài)和酯鍵合態(tài)中,且游離態(tài)中的槲皮素和山奈酚含量是酯鍵合態(tài)的2倍多。游離態(tài)中山奈酚的含量為1 103.7 μg/g,與彭國(guó)霞研究的茶花蜂花粉游離態(tài)中山奈酚的含量相近[24]。對(duì)羥基苯甲酸僅存在于酯鍵合態(tài)中,含量為72.5 μg/g。p-香豆酸、阿魏酸和鞣花酸是甲醇不溶態(tài)的主要成分。糖苷鍵合態(tài)中以沒食子酸和山奈酚為主,但均低于游離態(tài)中的含量。

玫瑰蜂花粉提取物中共檢出7種酚類化合物,其中鞣花酸含量最高,主要存在于游離態(tài)中,為315.56 μg/g,分別是酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)的5倍和19倍,高于莊永亮等報(bào)道的玫瑰蜂花粉游離態(tài)中鞣花酸的含量[25],可能是萃取方法不同造成的差異。甲醇不溶態(tài)中沒食子酸含量為121.40 μg/g,約為游離態(tài)中的3倍。肉桂酸在游離態(tài)和酯鍵合態(tài)中均有分布,甲醇不溶態(tài)中痕量檢出。山奈酚在游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)中均有分布,這與茶花蜂花粉中山奈酚的分布類似。

油菜蜂花粉提取物中共檢出8種,其中含量較高的是柚皮素、蘆丁、槲皮素和p-香豆酸。柚皮素主要以游離態(tài)的形式存在,含量為1 509.46 μg/g,在前人研究的蜂花粉成分中未見報(bào)道。蘆丁在游離態(tài)和酯鍵合態(tài)中的含量分別為129.87、229.83 μg/g,均低于Kakonien等人研究的油菜蜂花粉醇提物中蘆丁的含量[26],這可能與提取方式和花粉不同地理來源有關(guān)。槲皮素多以游離態(tài)的形式存在,含量為283.38 μg/g,是酯鍵合態(tài)中的4.7倍,在糖苷鍵合態(tài)中痕量檢出。p-香豆酸在游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)中均有檢出,其中游離態(tài)中含量為186.57 μg/g,遠(yuǎn)高于其他2種形態(tài)中的含量。

注：峰1 沒食子酸；峰2 對(duì)羥基苯甲酸；峰3 2,4-二羥基苯甲酸；峰4 丁香酸；峰5 p-香豆酸；峰6 阿魏酸；峰7 蘆?。环? 鞣花酸；峰9 肉桂酸；峰10 槲皮素；峰11 柚皮素；峰12 山奈酚；峰13 異甘草素。圖1 3種蜂花粉不同存在形態(tài)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of different phenolic extracts from three kinds of bee pollen

總之,蜂花粉游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)和糖苷鍵合態(tài)酚類化合物的組成與含量有較大的差別,且主要以游離態(tài)和酯鍵合態(tài)形式存在。

表1 3種蜂花粉酚類化合物的組成與含量Tab.1 Profile and content of phenolic extracts in three kinds of bee pollen

2.1.2 總酚和總黃酮含量 3種蜂花粉總酚和總黃酮含量見表2。不同存在形態(tài)酚類提取物中總酚、總黃酮含量有顯著性差異(P<0.05),3種蜂花粉中游離態(tài)總酚的含量最高,分別占4種形態(tài)總和的55.47%、47.92%、57.39%,其次是酯鍵合態(tài),分別占4種形態(tài)總和的24.04%、39.40%、20.84%,含量最低的是甲醇不溶態(tài)。茶花蜂花粉的總酚總量最高,玫瑰蜂花粉和油菜蜂花粉總量相近,兩者無顯著性差異。本研究中茶花蜂花粉(湖北省)游離態(tài)總酚含量為11.26 mg GAE/g,高于彭國(guó)霞等人報(bào)道的5個(gè)產(chǎn)地(湖南、安徽、浙江、四川、江西)的茶花蜂花粉,其報(bào)道中總酚含量為8.41～8.97 mg GAE/g[27],說明不同地理來源的蜂花粉總酚含量可能有所不同。

由表2知,4種不同存在形態(tài)酚類提取物的總黃酮分布不同。與上述酚酸的分布類似,茶花蜂花粉的游離態(tài)總黃酮含量最高,達(dá)到56.63%,酯鍵合態(tài)含量占總量的29.76%,最低是甲醇不溶態(tài),含量占比為3.81%;玫瑰蜂花粉的游離態(tài)黃酮占4種形態(tài)黃酮總量的50.68%,其次是酯鍵合態(tài)為37.89%,甲醇不溶態(tài)和糖苷鍵合態(tài)黃酮含量占比分別為7.11%、4.33%(P<0.05);油菜蜂花粉游離態(tài)的黃酮含量顯著高于其他3種形態(tài)的黃酮含量(P<0.05),甲醇不溶態(tài)與糖苷鍵合態(tài)的黃酮含量最低。從蜂花粉的總黃酮含量來看,三者無顯著性差異且本研究中玫瑰蜂花粉總黃酮含量高于陳南迪等人測(cè)得的玫瑰蜂花粉(4.29 mg RE/g)[28]。

表2 3種蜂花粉的總酚和總黃酮含量Tab.2 Total phenolic and total flavonoid content of three kinds of bee pollen

2.2 不同存在形態(tài)酚類化合物的抗氧化活性

2.2.1 Fe2+絡(luò)合能力 Fe2+誘導(dǎo)芬頓反應(yīng),生成強(qiáng)氧化性的羥基自由基[29],因此可通過Fe2+絡(luò)合力評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性的強(qiáng)弱。蜂花粉4種存在形態(tài)的酚類物質(zhì)對(duì)Fe2+的絡(luò)合能力見表3。不同存在形態(tài)酚類物質(zhì)絡(luò)合Fe2+的能力具有顯著性差異(P<0.05),游離態(tài)絡(luò)合Fe2+的能力最強(qiáng),達(dá)到0.33～0.45 mg Na2EDTA/g之間,其次是酯鍵合態(tài),絡(luò)合能力為0.22～0.29 mg Na2EDTA/g,糖苷鍵合態(tài)絡(luò)合Fe2+的能力最弱。3種蜂花粉甲醇不溶態(tài)的Fe2+絡(luò)合能力都強(qiáng)于糖苷鍵合態(tài),這可能與其多酚組成有關(guān)。

表3 3種蜂花粉的Fe2+絡(luò)合能力Tab.3 Ferrous ion-chelatingactivity of three kinds of bee pollen

2.2.2 Fe3+還原能力 Fe3+還原能力常用于評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化活性。低pH條件下,Fe3+-TPTZ復(fù)合物被還原劑還原為Fe2+-TPTZ復(fù)合物,在593nm有最大吸收波長(zhǎng)[30]。3種蜂花粉游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)和糖苷鍵合態(tài)的酚類物質(zhì)Fe3+的還原能力見表4,不同存在形態(tài)的酚類物質(zhì)對(duì)Fe3+的還原能力各不相同,具有顯著性差異(P<0.05)。游離態(tài)酚類物質(zhì)還原能力最強(qiáng),每克該提取物的還原能力相當(dāng)于19.46～24.57 mg Trolox,是甲醇不溶態(tài)的5～10倍,其次是酯鍵合態(tài),為10.93～16.68 mg Trolox/g。本研究茶花蜂花粉游離態(tài)Fe3+還原能力顯著高于彭國(guó)霞等人測(cè)得茶花粉游離態(tài)Fe3+還原能力(5.37 mg Trolox/g)[24]。Fe3+還原能力隨著總酚、總黃酮含量的上升而增強(qiáng),與總酚含量有較強(qiáng)相關(guān)性[31]。

表4 3種蜂花粉的Fe3+還原能力Tab.4 Ferric reducing antioxidant power of three kinds of bee pollen

2.2.3 DPPH自由基清除能力 DPPH是一種穩(wěn)定的自由基,它可接受電子或氫自由基成為穩(wěn)定分子,在抗氧化劑的存在時(shí)被還原,廣泛用于測(cè)定可清除活性氧的化合物的抗氧化能力[32]。本研究中,不同存在形態(tài)的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基清除能力以IC50值衡量,IC50值與清除能力成反比。由表5可知,游離態(tài)酚類物質(zhì)清除能力最強(qiáng),為6.86～8.07 mg/mL,其中玫瑰蜂花粉是8.07 mg/mL,低于張燕新測(cè)得玫瑰蜂花粉(10.03 mg/mL)[33],可能與產(chǎn)地、品種有關(guān);酯鍵合態(tài)的清除能力次之,在9.26～13.77 mg/mL之間;甲醇不溶態(tài)清除能力最弱。蜂花粉不同存在形態(tài)的酚類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力不同,這與其酚類物質(zhì)的種類和含量有關(guān)。

表5 3種蜂花粉的DPPH自由基清除能力Tab.5 DPPH radical scavenging ability of three kinds of bee pollen

2.3 對(duì)·OH誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用

Fe2+條件下,芬頓反應(yīng)中過氧化氫(H2O2)生成羥基自由基(·OH),能夠破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),而酚類物質(zhì)能夠絡(luò)合Fe2+或清除H2O2,阻止Fenton反應(yīng)的發(fā)生,減少DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的破壞[34]。由圖2可知,茶花蜂花粉中不同存在形態(tài)酚類物質(zhì)對(duì)·OH誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷都具有保護(hù)作用。其中,游離態(tài)酚類物質(zhì)對(duì)DNA的保護(hù)高達(dá)97.58%,顯著高于其他3種形態(tài)(P<0.05),酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)依次降低,分別為85.89%、79.29%、51.14%(P<0.05),這可能與茶花蜂花粉游離態(tài)酚類提取物中高含量的沒食子酸、丁香酸、槲皮素和山奈酚有關(guān)。由圖3和圖4可知,玫瑰蜂花粉和油菜蜂花粉中4種形態(tài)酚類物質(zhì)對(duì)·OH誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用均與茶花蜂花粉相似,游離態(tài)酚類物質(zhì)的保護(hù)率>酯鍵合態(tài)>糖苷鍵合態(tài)>甲醇不溶態(tài),對(duì)質(zhì)粒DNA的保護(hù)能力與酚類含量呈正相關(guān)性?？傊?茶花蜂花粉對(duì)·OH引起的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用最強(qiáng),油菜蜂花粉次之,玫瑰蜂花粉最弱。

注:泳道1是0.5 μg pR322DNA(正常組);泳道2是0.5 μg pBR322DNA+1 μL 1 mM FeSO4+1 μL 1% H2O2(模型組);泳道3～6是0.5 μg pBR322DNA+1 μL 1 mM FeSO4+1 μL 1% H2O2+3 μL茶花蜂花粉不同存在形態(tài)酚類物質(zhì)(泳道3～6分別是游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)、糖苷鍵合態(tài))。圖2 茶花蜂花粉對(duì)·OH誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effect of Camellia Japonica bee pollen on plasmid DNA oxidative damage induced by hydroxyl radical

注:泳道1是0.5 μg pBR322DNA(對(duì)照組);泳道2是0.5 μg pBR322DNA+1 μL 1 mM FeSO4+1 μL 1% H2O2(模型組);泳道3～6是0.5 μg pBR322DNA+1 μL 1 mM FeSO4+1 μL 1% H2O2+3 μL玫瑰蜂花粉不同存在形態(tài)酚類物質(zhì)(泳道3～6分別是游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)、糖苷鍵合態(tài))。圖3 玫瑰蜂花粉對(duì)·OH誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.3 Protective effect of rose bee pollen on plasmid DNA oxidative damage induced by hydroxyl radical

注:泳道1是0.5 μg pBR322DNA(對(duì)照組);泳道2是0.5 μg pBR322DNA+1 μL 1 mM FeSO4+1 μL 1% H2O2(模型組);泳道3～6是0.5 μg pBR322DNA+1 μL 1 mM FeSO4+1 μL 1% H2O2+3 μL油菜蜂花粉不同存在形態(tài)酚類物質(zhì)(泳道3～6分別是游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、甲醇不溶態(tài)、糖苷鍵合態(tài))。圖4 油菜蜂花粉對(duì)·OH誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of rape bee pollen on plasmid DNA oxidative damage induced by hydroxyl radical

3 結(jié)論

本文研究了茶花蜂花粉、玫瑰蜂花粉、油菜蜂花粉中4種存在形態(tài)的酚類化合物的組成與含量、抗氧化活性及其對(duì)·OH引起的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明,不同存在形態(tài)酚類化合物的多酚組成及含量有一定的差異,沒食子酸、丁香酸、槲皮素和山奈酚是茶花蜂花粉的游離態(tài)和酯鍵合態(tài)提取物的主要成分。游離態(tài)提取物的總酚、總黃酮含量最高,抗氧化活性也最強(qiáng),對(duì)·OH介導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)效果最好,其次是酯鍵合態(tài)提取物。因此，在開發(fā)蜂花粉抗氧化食品時(shí),可以主要考慮游離態(tài)和酯鍵合態(tài)的酚類物質(zhì)的提取與產(chǎn)品開發(fā)。本研究為蜂花粉抗氧化功能食品的開發(fā)提供理論參考。