趙鋼艷，熊將軍，劉靈芝，王明明，王 璨，易小明

湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院/湖南省直中醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南株洲 412000

結(jié)直腸癌(CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球每年新發(fā)患者約110萬例，死亡患者達(dá)88萬例[1]。近年來，隨著我國人民生活水平的提高，CRC的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢，嚴(yán)重威脅人民的身體健康[2]。深入研究CRC的病因及發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，對臨床診斷及治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度約為200～300 bp的非編碼RNA分子，發(fā)揮基因調(diào)控、分子支架的功能，廣泛參與炎癥、免疫及腫瘤等多種生理病理過程[3-4]。研究表明lncRNA在腫瘤中發(fā)揮重要作用[4]。FOXC2-AS1基因位于16q24.1，是一種能調(diào)控基因表達(dá)的lncRNA，參與細(xì)胞發(fā)育、分化及衰老等過程的調(diào)控[5]。研究表明，lncRNA FOXC2-AS1在非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤等腫瘤中存在表達(dá)異常的現(xiàn)象[6-7]，能夠抑制抑癌基因P16的表達(dá)，促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)展。Zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)基因位于7q36.1，該基因編碼的蛋白屬于多梳蛋白復(fù)合物家族成員，參與細(xì)胞增殖、傳代等，具有維持促增殖基因的持續(xù)轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的功能。RINKE等[8]報(bào)道，EZH2在腫瘤中發(fā)揮致癌基因的作用，如在白血病、乳腺癌等腫瘤中均能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移等。此外，腫瘤中EZH2的表達(dá)升高還參與腫瘤化療耐藥性的形成，可能是新的腫瘤診斷及治療靶點(diǎn)[9]。目前CRC中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1與EZH2相關(guān)的研究報(bào)道較少。本研究通過研究CRC組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1與EZH2的表達(dá)，探討二者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年2月至2015年2月于本院診治的86例CRC患者的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)CRC診斷均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷；(2)初次診治，患者以往無放化療、靶向治療病史；(3)臨床病理及隨訪資料完整，患者無精神障礙性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有潰瘍性結(jié)腸炎、急慢性胃腸道炎癥及自身免疫性疾病等。(2)有其他器官惡性腫瘤病史。(3)伴嚴(yán)重的心肺等臟器功能衰竭。86例CRC患者中男51例，女35例；年齡29～78歲，平均(51.5±7.2)歲；直腸癌31例，結(jié)腸癌55例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者62例；腫瘤最大徑≤3 cm者60例，>3 cm者26例；腫瘤分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期26例，Ⅲ期22例，Ⅳ期6例；病理分級(jí)：高中分化61例，低分化25例。本研究經(jīng)患者及家屬知情同意并已簽署知情同意書，且經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測lncRNA FOXC2-AS1及EZH2中mRNA表達(dá) 取術(shù)中黃豆粒大小的癌組織，以及距癌組織邊緣3 cm以上的正常組織(經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷)作為癌旁組織，標(biāo)本置于液氮中保存。取50 mg組織，應(yīng)用Trizol法提取組織中總RNA，分光光度法鑒定RNA的濃度及純度，吸光度(A)260/A280為1.8～2.1，無菌無酶水溶解后在-80 ℃條件下保存。以總RNA為模板，用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。FOXC2-AS1正向引物序列為5′-CCT TCC TGG CTG TTC ATC GG-3′，反向引物序列為5′-TGG AAA TAA GTG GCA CGC CC-3′；EZH2正向引物序列為5′-ATC AGA GTA CAT GCG ACT GAG A-3′，反向引物序列為5′-GCT GTA TCC TTC GCT GTT TCC-3′；內(nèi)參基因β-actin正向引物序列為5′-TTC CTT CCT GGG CAT GGA GTC-3′，反向引物序列為5′-TCT TCA TTG TGC TGG GTG CC-3′。反應(yīng)體系20 μL，Master Mix 10 μL，正向及負(fù)向引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均在ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。采用相對循環(huán)閾值(Ct值)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢測lncRNA FOXC2-AS1及EZH2 mRNA的相對表達(dá)水平，ΔCt = Ct待測基因-Ctβ-actin。

1.2.2免疫組化法檢測EZH2蛋白表達(dá) 將癌組織及癌旁組織用中性甲醛固定24 h后，石蠟包埋切片，60 ℃烤箱中烤片3 h；二甲苯脫蠟2遍；梯度水化；微波爐法抗原熱修復(fù)；3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶0.5 h；5%羊血清封閉0.5 h；一抗4 ℃孵育過夜，EZH2一抗稀釋比1∶500，抗體購自美國Abcam公司，貨號(hào)ab227648；二抗孵育2 h；二氨基聯(lián)苯胺顯色2 min；蘇木精復(fù)染30 s；梯度脫水，封片鏡檢。制備羊抗人Notch、Dll4多克隆抗體(工作濃度為1∶500)和即用型二抗(工作濃度為1∶2 000)；二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，光鏡觀察。采用二級(jí)計(jì)分法，結(jié)果以染色面積評分×染色強(qiáng)度評分表示，染色面積評分：<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)度評分：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐色為3分。結(jié)果<2分判定為陰性，≥2分判定為陽性。

2 結(jié) 果

2.1癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2 mRNA表達(dá)水平比較 癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2 mRNA相對表達(dá)水平均高于癌旁組織(t=29.837、19.736，均P<0.05)，見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2 mRNA表達(dá)水平比較

2.2癌組織與癌旁組織中EZH2蛋白表達(dá)水平比較 癌組織EZH2蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核，癌組織中EZH2蛋白表達(dá)陽性率為88.4%(76/86)，癌旁組織中EZH2蛋白表達(dá)陽性率為10.5%(9/86)，癌組織中EZH2蛋白表達(dá)陽性率高于癌旁組織(χ2=104.410，P<0.05)。見圖2。

注：A為癌組織EZH2蛋白陽性表達(dá)；B為癌旁組織EZH2蛋白陽性表達(dá)。

2.3癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1與EZH2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1與EZH2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.611，P<0.05)。

2.4癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1蛋白表達(dá)水平及EZH2蛋白陽性表達(dá)與患者腫瘤TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分化程度及是否伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1蛋白表達(dá)水平、EZH2蛋白陽性表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期癌組織(P<0.05)。

表1 癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

續(xù)表1 癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2蛋白陽性表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.5癌組織中不同lncRNA FOXC2-AS1、EZH2表達(dá)水平患者生存率比較 86例CRC患者中，死亡41例，存活45例，5年總體生存率為52.3%。lncRNA FOXC2-AS1高表達(dá)組44例，死亡30例，存活14例；lncRNA FOXC2-AS1低表達(dá)組42例，死亡11例，存活31例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明lncRNA FOXC2-AS1高表達(dá)組患者5年總體生存率明顯低于lncRNA FOXC2-AS1低表達(dá)組患者(P<0.05)。EZH2蛋白高表達(dá)組42例，死亡29例，存活13例；EZH2蛋白低表達(dá)組44例，死亡12例，存活32例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明EZH2蛋白高表達(dá)組患者5年總體生存率低于EZH2蛋白低表達(dá)組患者(P<0.05)。見圖3。

注：A為不同lncRNA FOXC2-AS1表達(dá)患者生存率比較；B為不同EZH2表達(dá)患者生存率比較。

3 討 論

近年來隨著我國人民飲食方式的改變及人口老齡化的加劇，CRC的發(fā)病率及病死率有逐漸升高的趨勢。目前CRC的治療主要包括手術(shù)治療、放化療、靶向藥物治療及免疫治療等，部分早期患者獲得良好的治療效果，5年總體生存率達(dá)60%[10]。但晚期轉(zhuǎn)移患者療效不佳，即使經(jīng)積極綜合治療后，患者的5年總體生存率低于10%。因此，有必要深入研究CRC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有效的早期診斷及藥物治療靶點(diǎn)。非編碼RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)不具有蛋白編碼功能，但參與調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，可分為lncRNA、微小RNA及環(huán)狀RNA等。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與細(xì)胞發(fā)育、分化及凋亡等生物學(xué)調(diào)控過程，與感染、免疫及腫瘤等密切相關(guān)，有可能成為新的疾病診斷治療的分子靶點(diǎn)[11]。

lncRNA lncRNA FOXC2-AS1是叉頭盒蛋白C2(FOXC2)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物，調(diào)控哺乳動(dòng)物的發(fā)育及分化等過程[12]。近年來研究表明，lncRNA FOXC2-AS1在骨肉瘤[13]及肺癌[6]等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并能夠作為一種致癌基因，抑制下游抑癌基因P15的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移。本研究中，CRC癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1表達(dá)上調(diào)。但其表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚，可能與FOXC2-AS1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。有研究報(bào)道，miR-548c-5p能夠結(jié)合于FOXC2-AS1 mRNA的3′非編碼區(qū)，導(dǎo)致FOXC2-AS1 mRNA的穩(wěn)定性下降，進(jìn)而降低lncRNA FOXC2-AS1的表達(dá)水平，但在CRC中miR-548c-5p表達(dá)水平降低，結(jié)合FOXC2-AS1 mRNA的能力降低，從而促進(jìn)lncRNA FOXC2-AS1表達(dá)[14-15]。此外，CRC癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1的表達(dá)水平與腫瘤分期有關(guān)，lncRNA FOXC2-AS1促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PAN等[16]報(bào)道，lncRNA FOXC2-AS1表達(dá)水平升高可以促進(jìn)CRC腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，激活蛋白酪氨酸激酶2(FAK)信號(hào)通路的傳導(dǎo)，增強(qiáng)FOXC2 mRNA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)CRC增殖、遷移和侵襲。因此，lncRNA FOXC2-AS1有可能成為新的CRC潛在有效治療靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步分析癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1的表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果表明高表達(dá)lncRNA FOXC2-AS1的CRC患者5年總體生存率降低，表明lncRNA FOXC2-AS1的高表達(dá)可能導(dǎo)致患者的不良預(yù)后，檢測癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1的表達(dá)有可能成為提示CRC患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

EZH2屬于多梳蛋白家族成員，位于人類染色體7q36.1，參與調(diào)控早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化及凋亡等生物學(xué)過程[17]。有研究報(bào)道，在舌鱗癌[18]、乳腺癌[19]等腫瘤中EZH2基因存在表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象，其能催化組蛋白H3賴氨酸27位的三甲基化，抑制下游抑癌基因P53等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及浸潤、轉(zhuǎn)移。本研究中，癌組織中EZH2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平升高，可能與CRC中EZH2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常有關(guān)。FENG等[20]研究表明，調(diào)控EZH2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子E2F轉(zhuǎn)錄因子1(E2F1)表達(dá)水平升高，E2F1結(jié)合EZH2的基因啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致EZH2表達(dá)水平升高。本研究中，CRC中癌組織中EZH2的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，表明CRC發(fā)生時(shí)EZH2促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其機(jī)制可能是EZH2的表達(dá)水平升高激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。李妍等[21]發(fā)現(xiàn)，EZH2的表達(dá)上調(diào)能夠抑制Wnt信號(hào)通路中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)N-鈣黏素的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。此外，本研究中高表達(dá)EZH2的患者生存預(yù)后較差，表明CRC癌組織中EZH2的表達(dá)可能有助于預(yù)測CRC患者的生存及預(yù)后。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CRC癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1與EZH2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，目前二者之間的具體作用機(jī)制尚不清楚，但CHEN等[22]在前列腺癌體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，lncRNA FOXC2-AS1可作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-1253的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)miR-1253的下游靶基因EZH2的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的增殖及惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，CRC癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2表達(dá)水平升高，lncRNA FOXC2-AS1與EZH2 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，可能均參與了CRC的發(fā)生發(fā)展。癌組織中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1、EZH2的高表達(dá)與腫瘤分期及患者不良預(yù)后有關(guān)，二者有可能成為新的診斷及治療CRC的分子標(biāo)志物，但其具體的作用機(jī)制和臨床意義需深入研究。