樊小群，李 歡，朱華雄，蔡慶果，何呂芬

海南省三亞市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南三亞 572000

隨著慢性乙型肝炎(CHB)臨床治愈觀(guān)點(diǎn)的提出，研究引起乙型肝炎病毒(HBV)感染不同轉(zhuǎn)歸的因素尤為重要，宿主基因變異可能影響HBV感染的不同轉(zhuǎn)歸[1]。人類(lèi)白細(xì)胞抗原(HLA)是人類(lèi)主要的組織相容性復(fù)合體(MHC)，是HBV感染的重要宿主因子之一。HLA基因多態(tài)性不僅與HBV的自發(fā)清除、血清轉(zhuǎn)化、CHB的持續(xù)感染密切相關(guān)，而且與疾病進(jìn)展、肝硬化和HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)展密切相關(guān)[2]。HLA-DR表位在抗HBV感染中發(fā)揮重要作用，且全基因組關(guān)聯(lián)研究已確定HLA-DR是HBV相關(guān)慢、急性肝衰竭易感的主要位點(diǎn)[3]?？笻BV感染免疫研究表明，HLA-DR對(duì)HBV感染不同轉(zhuǎn)歸的影響可能是由于肽-主要組織相容性復(fù)合物(pMHC)與T淋巴細(xì)胞受體(TCR)相互作用，從而影響初始T淋巴細(xì)胞的分化途徑，pMHC與TCR相互作用的變化主要受HLA分子結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平的影響[4]。已有研究明確HLA-DR分子結(jié)構(gòu)與HBV慢性感染相關(guān)[5]，而對(duì)于HLA-DR mRNA的表達(dá)水平在HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸中的作用報(bào)道較少，目前HLA-DR mRNA表達(dá)水平作為判斷膿毒血癥和食管癌等疾病預(yù)后的指標(biāo)[6-7]，因此探討HLA-DR在HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸中的特點(diǎn)有十分重要的意義。本研究選擇本地區(qū)人群中急性、急性自限和不同疾病階段的慢性HBV感染者，疫苗免疫者和乙型肝炎5項(xiàng)[血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(抗-HBs)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、乙型肝炎E抗體(抗-HBe)、乙型肝炎核心抗體(抗-HBc)]結(jié)果陰性的健康人群，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)各組外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中HLA-DR mRNA的表達(dá)水平，分析在不同HBV感染者中HLA-DR mRNA的表達(dá)水平差異；HLA-DR mRNA表達(dá)水平與疫苗免疫的關(guān)系；HLA-DR mRNA表達(dá)水平與HBeAg抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)化的關(guān)系，為HLA-DR mRNA表達(dá)水平在HBV感染患者的預(yù)后評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2014年8月至2017年10月住院和門(mén)診HBV感染患者101例及體檢中心的體檢健康者53例為研究對(duì)象，均為漢族，無(wú)血緣關(guān)系。HBV感染患者符合2010年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[8]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：(1)HBsAg陽(yáng)性、HBeAg陽(yáng)性或者陰性、抗-HBe陽(yáng)性或者陰性，HBV-DNA陽(yáng)性；(2)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)持續(xù)或反復(fù)升高，或在肝組織學(xué)檢查中發(fā)現(xiàn)肝炎病變；(3)未經(jīng)抗病毒治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他類(lèi)型肝炎病毒感染；(2)合并心、腎和造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病、自身免疫性疾病、肝硬化、肝癌。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

本研究共納入急性HBV感染者7例為急性組；不同感染階段的慢性HBV感染者64例為慢性組(CHB輕度感染24例，中度感染12例，重度感染8例，攜帶者20例)；急性自限者30例為急性自限組。體檢健康者53例，其中疫苗免疫者35例為疫苗免疫組，乙型肝炎5項(xiàng)全陰者18例為5項(xiàng)全陰組。急性自限組：既往否認(rèn)有肝炎病史或抗HBc-IgM檢測(cè)陰性，HBsAb、HBeAb和抗-HBc均為陽(yáng)性。疫苗免疫組：經(jīng)HBV疫苗免疫且乙型肝炎5項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果HBsAb陽(yáng)性，其余4項(xiàng)均陰性。5項(xiàng)全陰組：即乙型肝炎5項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 記錄受試者的性別、年齡、ALT、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)和乙型肝炎5項(xiàng)等指標(biāo)，并采集外周血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，離心分離血漿和血細(xì)胞備用。

1.2.2HBV-DNA檢測(cè) 受試者血漿按HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)(購(gòu)自深圳凱杰生物工程有限公司)進(jìn)行HBV-DNA提取、擴(kuò)增和定量檢測(cè)。MX3000P qPCR儀購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。

1.2.3HLA-DR mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 受試者血細(xì)胞使用人外周血淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)制備PBMC備用；使用RNA提取試劑盒(購(gòu)自北京百泰克生物有限公司)提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自北京百泰克生物有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用探針?lè)╭PCR試劑盒(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)檢測(cè)各組HLA-DR和β-actin mRNA表達(dá)水平，分別記錄循環(huán)閾值(Ct)值，并用2-ΔΔct法進(jìn)行HLA-DR mRNA表達(dá)水平相對(duì)定量分析。HLA-DR和β-actin的引物和探針購(gòu)自上海吉瑪公司。HLA-DR序列F：5′-GAC TTG ATG CTG ATG AGA TTT TCC-3′，R：5′-GAG CCT CAA AGC TGG CAA ATC-3′。β-actin序列F：5′-CTG GAA CGG TGA AGG TGA CA-3′，R：5′-CAC CTC CCC TGT GTG GAC TT-3′。

2 結(jié) 果

2.1一般資料比較 4組性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，年齡、ALT、AST和TBIL水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，符合該疾病分布狀態(tài)。見(jiàn)表1。

表1 一般資料比較

2.2HLA-DR mRNA表達(dá)水平與不同HBV感染者及疫苗免疫的關(guān)系 HLA-DR mRNA表達(dá)水平在急性自限組(2.75±0.57)中最高，5項(xiàng)全陰組(0.99±0.36)中最低，各組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.75，P<0.05)。其中，急性自限組、慢性組(2.51±0.23)HLA-DR mRNA表達(dá)水平高于疫苗免疫組(1.83±0.21，t=4.767、4.576，均P<0.05)，但急性自限組、慢性組和急性組(1.92±0.55)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.550、1.910，均P>0.05)。慢性組、疫苗免疫組HLA-DR mRNA表達(dá)水平均高于5項(xiàng)全陰組(t=7.346、3.374，均P<0.05)。

2.3HLA-DR mRNA表達(dá)水平與不同感染階段慢性HBV感染者的關(guān)系 重度(2.98±1.03)、中度(2.54±0.76)、輕度(2.50±0.87)慢性HBV感染者HLA-DR mRNA表達(dá)水平和HBV攜帶者(1.72±0.60)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.540，P=0.657)。

2.4慢性HBV感染者HLA-DR mRNA 在不同 HBV-DNA表達(dá)水平中的比較 慢性HBV感染者共64例，隨機(jī)選取其中62例患者進(jìn)行HBV-DNA定量檢測(cè)，根據(jù)HBV-DNA水平不同分6組[<1×103、(1×103～<1×104、1×104～<1×105、1×105～<1×106、1×106～<1×107、≥1×107IU/mL]，其HBV-DNA mRNA表達(dá)水平分別為1.81±0.69、1.71±0.58、2.84±0.92、3.44±1.45、1.88±0.60、1.42±0.39。不同HBV-DNA水平組HLA-DR表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.204，P=0.319)。但是在HBV-DNA水平為1×103～<1×104IU/mL，1×104～<1×105IU/mL時(shí)，其HLA-DR mRNA表達(dá)水平均較高，HBV-DNA mRNA水平為1×105～<1×106IU/mL的感染者HLA-DR mRNA表達(dá)水平最高，隨著HBV-DNA的水平逐漸降低，PBMC中的HLA-DR mRNA表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢(shì)。

2.5HLA-DR mRNA表達(dá)水平在慢性HBV感染者不同HBeAg血清學(xué)狀態(tài)中的比較 HBeAg陰性的慢性HBV感染者HLA-DR mRNA表達(dá)水平(2.28±1.12)高于HBeAg陽(yáng)性的慢性HBV感染者(1.48±0.65)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.267,P=0.069)。

3 討 論

HBV感染后引起不同轉(zhuǎn)歸主要是宿主免疫系統(tǒng)對(duì)病毒抗原的免疫應(yīng)答所致。免疫識(shí)別病毒需要HLA-Ⅱ類(lèi)分子把病毒抗原呈遞給CD4+T淋巴細(xì)胞后清除病毒或持續(xù)感染[9]。在HLA-Ⅱ類(lèi)分子中HLA-DR最具多態(tài)性，HLA-DR分子在CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的過(guò)程中起重要作用，不同HLA-DR表達(dá)水平在免疫功能中的作用不同。HLA-DR表達(dá)水平不同激活的CD4+T淋巴細(xì)胞功能亞群不同，致使其發(fā)揮不同抗病毒作用，進(jìn)而導(dǎo)致不同轉(zhuǎn)歸[10]。有研究表明在慢性HBV感染者樹(shù)突細(xì)胞和單核細(xì)胞中HLA-DR表達(dá)水平均低于對(duì)照組，并認(rèn)為其可能是抗原遞呈功能失調(diào)及體液和細(xì)胞免疫紊亂導(dǎo)致 HBV持續(xù)感染和患者病情遷延不愈的重要因素之一[11-12]。PBMC 作為免疫細(xì)胞的集合體，其在 HBV 感染過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，但目前關(guān)于HBV感染后PBMC中HLA-DR mRNA表達(dá)水平變化的報(bào)道較少。本研究對(duì)外周血PBMC中HLA-DR mRNA在不同感染組中的表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)急性自限組表達(dá)水平最高，慢性組次之，五項(xiàng)全陰組表達(dá)水平最低，不同HBV感染狀態(tài)和疫苗免疫均可誘導(dǎo)HLA-DR mRNA表達(dá)水平不同程度地升高，原因可能是HLA-DR mRNA在靜息T淋巴細(xì)胞上表達(dá)很弱，受抗原刺激后，HLA-DR被激活，產(chǎn)生細(xì)胞免疫，進(jìn)而消滅細(xì)胞內(nèi)感染的病原體[13]，這也與毛學(xué)鋒等[14]發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者外周血PBMC中HLA-DR mRNA表達(dá)水平比健康對(duì)照組高的結(jié)論一致。

同時(shí)本研究對(duì)慢性HBV感染者的不同感染階段、HBV-DNA水平、和HBeAg血清學(xué)狀態(tài)進(jìn)行了分層分析，發(fā)現(xiàn)了HBeAg陰性的慢性HBV感染者HLA-DR mRNA表達(dá)水平高于HBeAg陽(yáng)性，與相關(guān)研究結(jié)果一致[15]，進(jìn)一步證明HLA-DR mRNA水平與HBeAg血清學(xué)狀態(tài)關(guān)系重大。HBV入侵時(shí)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重大影響，章松平等[13]在慢性HBV感染者的研究中，發(fā)現(xiàn)病毒水平較高時(shí)，HLA-DR mRNA表達(dá)水平較低，與本研究相符。

TAN等[3]通過(guò)全基因關(guān)聯(lián)研究已明確HLA-DR是HBV相關(guān)ACLF易感性的主要位點(diǎn)。 金茜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在重度乙型肝炎患者外周血中，HLA-DR mRNA表達(dá)水平高于中度和輕度乙型肝炎患者。本研究中，雖然HLA-DR mRNA表達(dá)水平在慢性感染者重度與中度中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但整體仍然是重度感染者高于其他感染者，提示HLA-DR mRNA表達(dá)水平與肝細(xì)胞的損傷程度有關(guān)。

綜上所述，本研究表明PBMC中HLA-DR mRNA表達(dá)水平能反映HBV感染和疫苗免疫狀態(tài)，以及肝細(xì)胞的損傷程度，這可為HLA-DR評(píng)價(jià)HBV感染轉(zhuǎn)歸提供參考依據(jù)，對(duì)深入認(rèn)識(shí)不同HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸機(jī)制和指導(dǎo)科學(xué)研究有重要意義，為HLA-DR mRNA表達(dá)水平在HBV感染患者的預(yù)后評(píng)價(jià)提供依據(jù)。