董德明，翟 敏，廖廷彥

湖北省棗陽市第一人民醫(yī)院兒科，湖北棗陽 441200

皰疹性咽峽炎常發(fā)生在幼兒時期，是一種急性上呼吸道感染性疾病，主要由腸道病毒感染所致，具有傳染性[1]。該病多發(fā)于夏秋季，臨床癥狀有高熱、咽痛、流涎、厭食等，患兒咽峽部及軟腭可見皰疹，并伴有多發(fā)性口腔潰瘍[2]。皰疹性咽峽炎常見于1～7歲兒童，可引發(fā)心肌炎、腦炎，嚴重威脅兒童的健康。腸道病毒感染可改變機體體液免疫，致使T淋巴細胞的數量和功能發(fā)生改變[3]。微小RNA(miRNA)能在機體炎癥相關通路中發(fā)揮作用，調節(jié)炎性反應。miR-21參與多種腫瘤和自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。研究表明，miR-21過表達可抑制腫瘤壞死因子-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-6的表達，并上調IL-10水平，抑制炎性反應[5]。miR-21在皰疹性咽峽炎中的表達及對炎性反應的影響報道較少。輔助性T淋巴細胞(Th)17和調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)是一對具有拮抗作用的T淋巴細胞亞群，參與維持機體免疫平衡，二者比例失衡與多種炎癥性疾病和自身免疫疾病的發(fā)病有關[6]。Th17/Treg平衡在疾病中所起的作用已被大量報道，但在皰疹性咽峽炎中的作用少有報道。本研究檢測了皰疹性咽峽炎患兒血清中miR-21水平及Th17/Treg平衡的變化，旨在探討二者的關系及在皰疹性咽峽炎進展過程中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年11月至2020年4月在本院就診的68例皰疹性咽峽炎患兒作為試驗組；選取同期在本院體檢的63例健康兒童作為對照組。試驗組年齡1～6歲，平均(3.59±1.18)歲；男36例，女32例；平均體質量指數(20.16±1.39)kg/m2；散居27例，幼托41例；平均心率(109.37±12.86)次/分；平均舒張壓(61.48±10.21)mm Hg，平均收縮壓(99.35±11.18)mm Hg。對照組年齡1～6歲，平均(3.82±1.36)歲；男32例，女31例；平均體質量指數(20.35±1.42)kg/m2；散居28例，幼托35例；平均心率(105.43±12.57)次/分；平均舒張壓(63.15±9.62)mm Hg，平均收縮壓(101.54±11.74)mm Hg。2組受試兒童年齡、性別、體質量指數、是否幼托、心率、舒張壓和收縮壓比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，所有受試兒童家屬均簽署知情同意書。

納入標準：(1)符合《諸福棠實用兒科學》皰疹性咽峽炎診斷標準[7]；(2)發(fā)病3 d內就診；(3)就診前兩周未使用激素或免疫調節(jié)劑；(4)7歲以下兒童。排除標準：(1)先天性心臟病者；(2)合并肝臟、腎臟、肺部疾病者；(3)先天性免疫缺陷者。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑(批號VB459280)購自上海一基實業(yè)有限公司；反轉錄試劑盒(批號KL266)購自上?？道噬锛夹g有限公司；實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒(批號KK4662)購自美國Kapa Biosystems公司；人轉化生長因子-β1(TGF-β1)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批號EK0513)購自美國Sciencell公司；IL-17 ELISA試劑盒(批號AE0176M/S)、IL-2 ELISA試劑盒(批號AE0054M/S)、IL-6 ELISA試劑盒(批號AE0048M/S)和IL-10 ELISA試劑盒(批號AE0064M/S)均購自南京善本生物科技有限公司；qPCR儀(型號100133)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；流式細胞儀(型號Gallios)購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品采集 抽取2組受試兒童的空腹外周靜脈血8 mL，其中3 mL外周血加入乙二胺四乙酸抗凝，用于制備外周血單個核細胞(PBMC)；另外5 mL以4 000 r/min離心5 min，吸取上層血清，-20 ℃保存。

1.3.2qPCR測定血清中miR-21相對表達水平 于-20 ℃冰箱中取出血清標本，按Trizol試劑說明書提取總RNA；按反轉錄試劑盒說明書制備cDNA。qPCR反應體系(20 μL)：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 6μL，每個標本設置3個復孔。根據目的基因設計相應引物，以U6為內參，序列見表1。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。根據各標本平均循環(huán)閾值(Ct)值，采用2-ΔΔCt法計算miR-21相對表達水平。

表1 miR-21及內參基因U6引物序列

1.3.3Th17、Treg的檢測 將采集的抗凝外周血采用密度梯度離心法提取PBMC，所得PBMC重懸至1×106個/mL，向重懸好的細胞中加入離子霉素1 μg/mL、佛波酯 50 ng/mL，在含高爾基蛋白轉換抑制劑的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 h。250×g離心5 min，將細胞進行固定、染色、透明化處理，其中Th17采用IL-17染色(IL-17陽性細胞為Th17)，Treg細胞采用Foxp3染色(Foxp3陽性細胞為Treg)。染色后，采用流式細胞儀檢測Th17、Treg表達，計算Th17、Treg百分率及Th17/Treg。

1.3.4血清中相關炎癥因子檢測 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中TGF-β1、IL-17、IL-2、IL-6和IL-10水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.12組miR-21相對表達水平比較 試驗組miR-21的相對表達水平(0.95±0.36)高于對照組(0.49±0.13)，差異有統計學意義(t=9.578,P<0.05)。

2.22組Th17百分率、Treg百分率、Th17/Treg比較 試驗組Th17百分率高于對照組，Treg百分率低于對照組，Th17/Treg高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組Th17百分率、Treg百分率、Th17/Treg比較

2.32組血清中相關炎癥因子水平比較 試驗組TGF-β1、IL-17和IL-6水平均高于對照組,IL-2和IL-10水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組血清中相關炎癥因子水平比較

2.4血清中miR-21相對表達水平與皰疹性咽峽炎患兒Th17/Treg及炎癥因子的相關性 皰疹性咽峽炎患兒血清中miR-21相對表達水平與Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相關(P<0.05)，與IL-2及IL-10水平均呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 皰疹性咽峽炎患兒血清中miR-21相對表達水平與Th17/Treg及炎癥因子的相關性

3 討 論

皰疹性咽峽炎大多由柯薩奇A型病毒和腸道病毒71型感染所致，偶發(fā)于青少年和成人，多發(fā)于兒童，同一個患兒可被多次感染，常伴有吞咽困難、發(fā)燒、咳嗽、腹痛、嘔吐等癥狀[8]。該病經呼吸道及糞口途徑傳播，也能通過手、衣、物等傳播。病程一般為4～6 d，臨床治療常采用對癥治療為主、口腔局部抗病毒藥物治療為輔的方式，預后良好[9]。少數患兒會出現肺水腫、腦炎、無菌性腦膜炎、心肌炎等并發(fā)癥，嚴重者可導致患兒死亡[10]。腸道病毒感染往往會引發(fā)機體炎性反應，導致多種炎癥因子表達異常。

miRNA是長度為18～25個核苷酸的非編碼小RNA，能夠與靶基因mRNA 3′非翻譯區(qū)結合，在轉錄后調控基因表達的過程中發(fā)揮重要作用[11]。miRNA參與人體多種生理活動，部分miRNA可參與調節(jié)炎性反應。miR-21在多種腫瘤中呈高表達，發(fā)揮致癌作用。研究發(fā)現，miR-21在結腸癌中相對表達水平升高，且與IL-6水平呈正相關，miR-21可能通過調節(jié)IL-6等炎癥因子調控病程進展中的炎癥狀態(tài)[12]。研究表明，miR-21在強直性脊柱炎患者血清中呈高水平，炎癥刺激miR-21相對表達水平升高[13]，與本研究結果相符。本研究發(fā)現，miR-21在皰疹性咽峽炎患兒血清中相對表達水平升高，提示miR-21可能參與皰疹性咽峽炎的發(fā)生、發(fā)展。CD4+T淋巴細胞在不同的微環(huán)境中分化為不同的T淋巴細胞亞群：Th1、Th2、Th17及Treg，在免疫應答中發(fā)揮不同作用[14]。Th1細胞參與細胞介導的免疫應答，Th2細胞可促進體液免疫，Th17主要發(fā)揮促炎作用，而Treg則可抑制炎性反應[15]。Th17/Treg失衡是多種免疫相關疾病發(fā)病的關鍵因素。本研究結果顯示，皰疹性咽峽炎患兒血清中Th17百分率升高，Treg百分率降低，Th17/Treg升高，提示Th17、Treg參與皰疹性咽峽炎的炎性反應。

Th17能合成并分泌大量IL-17，已成為主要的致病性T淋巴細胞亞群，能產生多種細胞因子，通過多種效應機制介導炎性反應的發(fā)生[16]。Treg可抑制CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的分化及功能，維持自身免疫耐受，抑制過度炎性反應[17]。Th17與Treg相互關聯，TGF-β1誘導Treg分化，在IL-6存在時則促進Th17分化[18]。有報道稱，miR-21在固有免疫反應前期相對表達水平升高，可激活相關免疫應答，促進炎性反應，在中后期，miR-21相對表達水平降低，此時可抑制IL-6水平，上調IL-10水平，加快免疫穩(wěn)態(tài)的恢復[19]。既往研究顯示，miR-21可能通過Toll樣受體途徑，從而影響T淋巴細胞的功能和分化，參與機體的免疫應答過程[20]。本研究皰疹性咽峽炎患兒血清中TGF-β1、IL-17和IL-6水平均升高，IL-2和IL-10水平均降低，此外，miR-21相對表達水平與Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相關，與IL-2及IL-10水平均呈負相關，提示miR-21可能通過影響T淋巴細胞的分化及功能，從而影響IL-6、IL-10、IL-17等炎癥因子，參與炎性反應。

綜上所述，miR-21相對表達水平及Th17/Treg在皰疹性咽峽炎患兒血清中均升高，且二者呈正相關，提示miR-21可能通過影響患兒的炎性反應，從而影響皰疹性咽峽炎的疾病進展。但本研究樣本量少，結果可能有局限性，尚需擴大樣本量，對相關機制進行深入探討。