于俊洲，李衛(wèi)明

(佳木斯市傳染病院，黑龍江 佳木斯 154007)

肝硬化是多種慢性肝病的重要臨床結(jié)局。代償期無(wú)明顯癥狀，一旦失代償則以門(mén)脈高壓和肝功能?chē)?yán)重?fù)p害為特征，病人常因消化道出血、腹水、膿毒癥、肝性腦病、肝腎綜合征和癌變導(dǎo)致多臟器功能衰竭而死亡。代償失代償病人5年生存率分別約84%和14%。代償肝硬化和慢性肝炎的臨床表現(xiàn)相似。通常血常規(guī)、肝功[1]等現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)室檢查難以鑒別。B超、CT、核磁共振提示肝表面不光滑、脾厚，均非特異。雖胃鏡可知食道胃底靜脈曲張，但是和肝穿刺活檢一樣存在風(fēng)險(xiǎn)，而且單個(gè)肝組織活檢標(biāo)本不一定能全面反映肝臟整體纖維化程度。需要新的血液生物標(biāo)志物來(lái)鑒別診斷。

基因理論是生物醫(yī)學(xué)的重心。人類(lèi)大部分疾病都與基因異常有關(guān)。微小核糖核酸是不編碼蛋白質(zhì)的RNA而參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2]，它與mRNA的短的互補(bǔ)序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3＇UTR區(qū)，即非翻譯區(qū)。要么降解產(chǎn)物，要么抑制翻譯過(guò)程，最終使靶蛋白降低，產(chǎn)生生理或病理效應(yīng)。目前，微小核糖核酸是很多疾病診療新的希望。miR-122是肝內(nèi)特異表達(dá)的微小RNA，miR-185是參與廣泛病理過(guò)程的微小RNA，國(guó)內(nèi)外對(duì)其做了部分研究，但是各家數(shù)據(jù)不一。鑒于早期肝硬化的及時(shí)診斷意義，本院課題組擬對(duì)肝硬化的微小RNA作進(jìn)一步研究。

1 材料和方法

1.1 主要儀器及試劑盒

實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI7500)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Mindray)。miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)；柱式microRNA提取試劑盒；miRNA第一鏈合成試劑盒(加尾法)。

1.2 標(biāo)本采集

隨機(jī)選2018-10～2019-10佳木斯市傳染病院確診代償期肝硬化住院患者48例作為肝硬化組，納入標(biāo)椎：符合2019年中華醫(yī)學(xué)會(huì)代償期肝硬化診斷依據(jù)(符合四條之一)：(1)組織學(xué)標(biāo)椎；(2)內(nèi)鏡示消化道靜脈曲張，除外非肝硬化門(mén)脈高壓；(3)B超或CT提示：脾大、門(mén)靜脈內(nèi)徑≥1.3cm；肝臟硬度測(cè)定(LSM)符合診斷界值；(4)符合以下2條：①PLT<100×109/L；②血清白蛋白<35g/L；③INR>1.3或PT延長(zhǎng)；④APRI評(píng)分>2。另選取41例確診慢性肝炎患者(乙肝26，丙肝8，其他7)作為肝炎組；再選取體檢中心健康體檢者36例作為對(duì)照組；以上研究對(duì)象均空腹8h后抽取肘靜脈血4管，其中2黃管取血清檢測(cè)生化和肝纖維化等指標(biāo)；1紫管查血常規(guī)；1紅管立即送工作臺(tái)抽提全部小RNA后，所得溶液置于-70℃保存。

1.3 檢測(cè)方法

化學(xué)放光免疫分析法檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸(HA)和Ⅳ型膠原(CⅣ)等指標(biāo)，常規(guī)檢測(cè)生化、血常規(guī)。

物品去RNA酶處理，冰上操作。Poly(A)加尾反應(yīng)和cDNA合成同步進(jìn)行，所得cDNA于4℃冰箱保存。

冰上配20μL反應(yīng)體系，每個(gè)模板配4個(gè)；miR-122-3P,miR-122-5P，miR-185-5P，U6(核內(nèi)小RNA)。4體系上游引物不同，miRNA122,185為成熟體引物(miRBase)，U6為通用的U6內(nèi)參的上游引物；下游引物共用；ROX染料校正液；DNA聚合酶；4種dNTP混合液；去RNA酶水等。預(yù)變性95℃,30S;變性95℃，5S;退火/延伸，60℃，30S;變性退火/延伸共40個(gè)循環(huán)，記錄循環(huán)閾值Ct，用2-ΔΔCt 計(jì)算比率做相對(duì)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)分析，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析(單因素方差分析one way ANOV),相關(guān)回歸方法描述推斷，P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

匯總分析各組樣本血液指標(biāo)，前白蛋白、血小板、總膽紅素、球蛋白、總膽汁酸、轉(zhuǎn)氨酶等提示早期肝纖維化的傾向均不理想，未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)比正常組，肝炎組和肝硬化組HA、CⅣ血清含量均升高,全血miR-122表達(dá)下降,miR-185表達(dá)升高。

肝炎組和肝硬化組比較，HA和CⅣ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-122-3P、miR-122-5P表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

肝硬化組合正常組比較，HA和CⅣ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-185-5P差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1～3。

圖1 miR-122-3P各組外周血的表達(dá)

圖2 miR-122-5P各組外周血的表達(dá)

圖3 miR-185-5P各組外周血的表達(dá)

對(duì)比正常組、肝炎組，肝硬化組HA、CⅣ血清含量升高明顯，而且與miR-185正相關(guān),見(jiàn)圖4～5。透明質(zhì)酸相關(guān)更明顯。

圖4 miR-185與透明質(zhì)酸相關(guān)分析

圖5 miR-185g與Ⅳ型膠原相關(guān)分析

3 討論

基因調(diào)控是生物表型發(fā)生和生物學(xué)行為的中心環(huán)節(jié)[3]，近年發(fā)現(xiàn)的miRNA揭示了全新的基因表達(dá)調(diào)控方式，它在調(diào)節(jié)那些“轉(zhuǎn)錄后或翻譯初”修飾的基因起關(guān)鍵作用。深入研究miRNA可望觸及生命的本質(zhì)[4]。血中的豐富的miRNA分子可能作為方便的診斷材料[5]。miRNA可以在組織和血液及其他體液中穩(wěn)定檢出，對(duì)于內(nèi)環(huán)境有公認(rèn)的作用[6]。微小核糖核酸通常在體液被包裹于細(xì)胞外囊泡，例如外泌體、微囊泡，釋放于各類(lèi)細(xì)胞，用簡(jiǎn)單方法測(cè)量其分布可以作為生化指標(biāo)[7]。

確定基因型與表型的聯(lián)系是個(gè)性化的醫(yī)學(xué)目的。而轉(zhuǎn)錄的3＇UTR區(qū)與微小RNA密切聯(lián)系[8]，影響生命過(guò)程。微小RNA是新發(fā)現(xiàn)的參與基因表達(dá)的非編碼RNA，存在于真核生物，其生物學(xué)特性是高度保守、時(shí)序表達(dá)和組織表達(dá)特異性[9]，大約19～25個(gè)核苷酸，非常之短，傳統(tǒng)的trizol法提取長(zhǎng)鏈RNA雖然可以，但是數(shù)十個(gè)核苷酸的短鏈RNA得率較低，有的反轉(zhuǎn)錄還用mRNA試劑盒，這樣的短RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA較困難。本課題實(shí)驗(yàn)采用吸附柱抽提全部的小分子RNA，合成cDNA時(shí)再加上polyA腺嘌呤尾，用oligo(dT)胸腺嘧啶與之配對(duì)，這樣反轉(zhuǎn)錄比較容易，根據(jù)微小RNA的成熟體序列設(shè)計(jì)特異引物，最后PCR擴(kuò)增成功。

透明質(zhì)酸(HA)廣泛存在與細(xì)胞外間隙，主要在肝代謝，肝硬化病人由于成纖維細(xì)胞合成HA增加，而肝內(nèi)皮細(xì)胞清除HA障礙，此二者導(dǎo)致血中HA升高，本實(shí)驗(yàn)注意到本采樣部分代償期肝硬化病人血中HA比其他血液指標(biāo)更敏感，而且與血中miR-185-5P的表達(dá)正相關(guān)，說(shuō)明二者可望成為早期診斷肝硬化的生物標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)的不足是，可能肝病樣本較少，比如需要分析肝癌，自身免疫性肝炎，華支睪吸蟲(chóng)病，其他原因?qū)е碌母螕p害等的HA和微小RNA的情況，還有miR-122和miR-185的靶蛋白都需要進(jìn)一步的研究。