王耀坤，王芳芳，張慧明，鄭小鵬，陳 光，楊克科

(1.佳木斯大學醫(yī)學部，黑龍江 佳木斯 154007；2. 臺州學院醫(yī)學院，浙江 臺州 318000；3. 黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是DM常見且嚴重的微血管并發(fā)癥之一，無特效療法[2,3]，尋找有效的治療策略迫在眉睫。中藥具有潛在的DN治療優(yōu)勢[4,5]，黃芩苷(baicalin, BAI)是中藥黃芩的生物活性提取物，對免疫、心血管、泌尿和神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用，并且具有清除各種自由基、抗氧化和抗炎的生理效能，可用于治療DN[6,7]。靶向制劑又叫做靶向給藥系統(tǒng)(Targeting drug delivery sstem,TDDS)，其主要作用是通過合適的載體攜帶藥物集中于目的病變部位(靶部位)，靶部位包括靶器官、靶組織、靶細胞及細胞內的某個靶點。溶菌酶是一種堿性球蛋白，因其分子量低、性質穩(wěn)定等優(yōu)點受到人們的重視。在腎靶向前體藥物載體選擇過程中，又發(fā)現(xiàn)溶菌酶合成容易、無毒、抗菌，尤其是成本低則成為最佳的選擇[8,9]。因此本課題選取黃芩苷為模型藥，溶菌酶為載體，設計并合成了黃芩苷-溶菌酶結合物，以腎近端小管細胞為靶部位，目標是改變原藥體內分布特點，以提高原藥在腎臟的濃度，同時減小原藥全身毒副作用，尤其對生殖系統(tǒng)和肝臟毒性的目的，以期為糖尿病腎病的有效治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料和試劑

黃芩苷由中藥標準對照品研究所提供；溶菌酶由山東康勤生物有限公司提供；乙腈、硼酸、四硼酸鈉、均購于天津市凱通化學試劑有限公司；葡聚糖凝膠G-25購于上海生化試劑撫生有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)由上海共價化學科技有限公司提供；1-羥基苯并三唑(HOBT)由無錫邁拓生物科技有限公司提供；鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)購于美國Sigma公司；檸檬酸鈉和檸檬酸購于武漢博士德生物技術公司；紫外-可見分光光度計(UV-2550)；傅立葉紅外光譜儀(VERTEX 70)；血糖儀和血糖試紙。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芩苷-溶菌酶結合物的制備

精密稱量溶菌酶 0.1001g，將其溶解于5mL 0.1mol/L的冷硼酸鹽緩沖液中(pH=7.99)。稱取黃芩苷 0.0999 g，EDC·HCl 0.1000 g和1-羥基苯并三唑(HOBT) 0.0501g分散在2.2mL乙腈中，快速攪拌，使之分散均勻。將該渾濁液加入到溶菌酶的硼酸鹽緩沖液中，快速攪拌，0℃反應18 h后，過濾。葡聚糖凝膠G-25過濾所得澄清溶液除去未反應的黃芩苷。溶液冷凍干燥后可見黃色疏松粉末，低溫保存。

1.2.2 黃芩苷-溶菌酶結合物的表征

1.2.2.1 紫外-可見吸收光譜

將溶菌酶、黃芩苷和黃芩苷-溶菌酶結合物溶于甲醇中，配成1mg/mL的溶液，放入紫外-可見吸收光譜的專用比色皿中進行測試。

1.2.2.2 紅外光譜

將溶菌酶、黃芩苷和黃芩苷-溶菌酶結合物分別與紅外光譜專用KBr晶體以 1:100 ～ 1:200的比例進行混合研磨，最后分別壓成透明薄片進行紅外光譜測試。

1.2.3 實驗動物分組、造模和藥物處理

雄性的清潔級SD大鼠(180～220g)50只，由哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心(動物許可證號SYXK(黑)2016-014)提供。本實驗隨機分組為：正常對照組(Con，7只)，糖尿病腎病模型組(DN，13只)，糖尿病腎病模型黃芩苷治療組(BAI，14只)和糖尿病腎病模型黃芩苷-溶菌酶治療組(BAI-LZM，13只)。STZ 65mg/kg腹腔注射進行造模，72 h后尾靜脈行血糖儀檢測大鼠空腹狀態(tài)下(禁食 ≥ 8h)血糖值，連續(xù)3d檢測大鼠空腹狀態(tài)下血糖值均≥16.7mmol/L確定糖尿病造模成功。

造模成功后，黃芩苷治療組給予黃芩苷160mg/kg·d灌胃，黃芩苷-溶菌酶治療組給予160mg/kg·d黃芩苷-溶菌酶結合物灌胃，正常對照組給予腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖溶液，8周后處死。

1.3 檢測指標

1.3.1 一般指標監(jiān)測: 正常記錄各組大鼠飲食和飲水量，隨時觀察其精神狀態(tài)及毛色變化，每周固定時間監(jiān)測血糖/體重變化。采用尾靜脈穿刺采血法取血，血糖檢測儀測定大鼠血糖值變化。

1.3.2 腎功能檢測： 大鼠眼球取血，分離血清后全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 黃芩苷-溶菌酶結合物反應原理

由反應機理(圖1A)我們可知，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和1-羥基苯并三唑(HOBT)先與酸發(fā)生反應，隨后胺進攻最終生成產(chǎn)物酞胺。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，先加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和1-羥基苯并三唑(HOBT)使其反應一段時間后再加溶菌酶合成的效果更好。本文選用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)作為合成步驟中的水溶性脫水劑既滿足了溶菌酶作為蛋白質需要反應條件溫和的條件，還使后期工藝處理更為簡單。而1-羥基苯并三唑(HOBT)為該合成過程中的輔助性親核試劑，1-羥基苯并三唑(HOBT)優(yōu)先同藥物分子中的羧酸發(fā)生反應生成活性脂，然后再與溶菌酶發(fā)生反應，使整個合成過程的反應速度加快同時還能夠提高收率。

2.2 紫外-可見吸收光譜對黃芩苷-溶菌酶結合物的定性分析

通過低溫攪拌的方法合成(圖1B)的黃芩苷-溶菌酶結合物進行了紫外-可見吸收光譜測試，黃芩苷-溶菌酶結合物的甲醇溶液在240～400nm區(qū)域內出現(xiàn)了兩個強吸收峰267nm和303nm，且所產(chǎn)生的吸收峰的峰型與黃芩苷大致相同，這可以初步證明該結合物中黃酮類的母體結構是存在的。但是兩條強峰的波長整體變短，出現(xiàn)了藍移，可能原因是溶菌酶與黃芩苷共同作用后，影響了黃芩苷結構電子發(fā)生π→π*躍遷和n→π*躍遷而導致的在276nm處產(chǎn)生一吸收強度較弱的峰，這與溶菌酶在277 nm處出現(xiàn)的n→π*躍遷引起的吸收帶是一致的。因此，本文所合成的黃芩苷-溶菌酶結合物從結構上與其反應物黃芩苷、溶菌酶的結構中的官能團一致，說明該方法可以制備出黃芩苷-溶菌酶結合物。

2.3 紅外光譜表征黃芩苷-溶菌酶結合物

在3500cm-1～3000cm-1波長范圍內，溶菌酶出現(xiàn)寬而強的吸收譜帶，為-OH(多締合的醇或酚)的伸縮振動特殊吸收帶，1500cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為苯環(huán)骨架振動(圖1C)。在3500cm-1～3000cm-1波長范圍內，黃芩苷則出現(xiàn)了尖銳的峰，為游離的-OH的伸縮振動產(chǎn)生的，3000cm-1處附近的多重峰為苯環(huán)上的C-H伸縮振動產(chǎn)生的，2000cm-1～1600cm-1處的泛頻峰主要是指芳環(huán)的不同的取代類型。本文采用化學方法合成的黃芩苷-溶菌酶結合物經(jīng)紅外光譜表征，在3500cm-1～3000cm-1波長范圍內出現(xiàn)寬而強的吸收譜帶是締合的醇或酚羥基伸縮振動產(chǎn)生的，在1715cm-1波長處出現(xiàn)吸收峰為C=O伸縮振動產(chǎn)生的，在1000cm-1附近的組頻峰為C-H面內彎曲振動。通過將黃芩苷、溶菌酶以及本文制備的黃芩苷-溶菌酶結合物等三種化合物的紅外光譜的檢測和比較，得出本文所制備的黃芩苷-溶菌酶結合物的結構與其反應物質黃芩苷、溶菌酶的結構中的官能團一致，且含有C=O，說明該方法可以制備出黃芩苷-溶菌酶結合物。

圖1 黃芩苷-溶菌酶結合物的合成和鑒定

2.4 黃芩苷-溶菌酶對DN大鼠的療效一般情況觀察

Con組SD大鼠動作靈活，皮毛光澤，飲食及尿量正常，模型組大鼠自DM模型構建成功后逐漸活動減少、皮毛無光，開始出現(xiàn)三多一少癥狀(多飲、多食、多尿、消瘦)。與DN組相比，治療組多飲、多食、多尿的情況于治療4周時有所好轉，治療8周時明顯改善。

2.5 黃芩苷-溶菌酶對DN大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和體重的影響

與Con組相比，DN組血糖明顯升高(P<0.001)，體重明顯降低(P<0.001)；與DN組相比，BAI與BAI-LZM組雖略有不同，但并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，BAI與BAI-LZM組亦無差異(P>0.05)。結果表明BAI與腎靶向BAI-LZM對大鼠的體重與血糖并無明顯影響 ,見圖2。

圖2 各組大鼠空腹血糖值和體重變化

2.6 黃芩苷-溶菌酶對DN大鼠腎功能的影響

與Con組大鼠相比，DN組大鼠的血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)水平升高顯著，可達到正常大鼠的2倍以上(P<0.05)；與DN組大鼠相比，BAI與BAI-LZM組大鼠的BUN和Scr水平均顯著降低；特別需要強調的是，與BAI組相比，BAI-LZM結合物給藥治療的大鼠BUN和Scr水平均明顯下降，與正常大鼠BUN和Scr水平相近。

表1 各組大鼠 BUN和Scr 比較

3 討論

DM是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。DN的病因及發(fā)病機制尚未完全清楚，目前認為是高血糖、高血壓、腎臟血流動力學異常等多因素參與，在一定遺傳背景下以及部分危險因素共同作用的結果。幾項臨床實驗表明控制血壓、血脂和血糖對DN的發(fā)展具有作用。然而，盡管嚴格控制血糖和血壓可能會減慢其進展，但許多DN患者仍不幸發(fā)展為ESRD。因此，尋找新的治療藥物和治療策略勢在必行。

中藥提取物具有高效低毒的優(yōu)點，在臨床上用于治療慢性腎臟疾病已有悠久的歷史。BAI是中藥黃芩的生物活性提取物，對免疫、心血管、泌尿和神經(jīng)系統(tǒng)都具有保護作用[3]。研究表明，BAI可以通過降低炎癥反應用于DN的臨床治療[3, 4]。因此本研究目的是通過制備黃芩苷-溶菌酶結合物，檢測其對糖尿病腎病腎損傷的干預作用，旨在為糖尿病腎病的有效治療提供新的理論和實驗依據(jù)。

實驗結果表明，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)為水溶性脫水劑，以1-羥基苯并三唑(HOBT)為輔助性親核試劑制得黃芩苷-溶菌酶結合物，并通過紫外-可見分光光度法與紅外光譜法進行了黃芩苷-溶菌酶結合物的定性分析，通過紫外光譜圖、紅外光譜圖中黃芩苷、溶菌酶、以及黃芩苷-溶菌酶結合物的比較分析，得出本文制備的黃芩苷-溶菌酶其結構中含有黃芩苷、溶菌酶的結構中的官能團以及目標產(chǎn)物所具備的C=O、-NH2，基本上可以證明此方法可以將黃芩苷和溶菌酶進行合成，但若想進一步對其結構進行研究還需通過其他的檢測方法更深層的分析。

所有慢性腎臟疾病發(fā)展的必然結局就是腎間質纖維化，最終導致終末期腎功能衰竭[10,11]。然而，相關文獻報道，黃芩苷能抑制不同組織器官纖維化的發(fā)生和發(fā)展，主要作用機制包括夠抑制促纖維因子表達、抑制纖維化信號通路、抗炎、抗氧化等，是一種具有開發(fā)潛力的多組織器官抗纖維化藥物[12,13]。

本實驗合成的黃芩苷-溶菌酶結合物，處理DN大鼠后對比了各組大鼠的一般狀態(tài)、空腹血糖值、血尿氮素(BUN)水平以及血肌酐(Scr)水平。實驗結果證明，與模型組大鼠相比，黃芩苷與黃芩苷-溶菌酶治療組大鼠一般狀況、空腹血糖、BUN和Scr水平均明顯下降；與黃芩苷治療組相比，黃芩苷-溶菌酶結合物治療組能更好的調控DN大鼠的BUN和Scr水平。本實驗采用黃芩苷為模型藥物，選用溶菌酶為載體，設計并合成了黃芩苷-溶菌酶結合藥物，能夠提高藥物在腎臟的濃度，減小藥物的毒副作用，明顯改善DN大鼠的腎功能，并為糖尿病腎病的有效治療提供新的方法。