李柏茹 ，秦雙建，李閏冰，蔡 穎 ，鄭 凱 ，曾 明，肖 芳，*，徐新云

(1.中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院，湖南 長沙410078；2.深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳 518055；3.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南 衡陽 421001)

大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM)是指大氣中空氣動力學直徑≤2.5 μm的顆粒物，可以經呼吸道直接進入支氣管和肺泡深處，甚至可以伴隨血液進入循環(huán)，到達全身各個臟器。2013 年國際癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer，IARC)將室外空氣污染的主要成分-大氣細顆粒物歸類為致癌物。PM可以誘導產生氧化應激、炎癥反應、免疫紊亂、DNA損傷和遺傳毒性、信號通路改變等。在一項中國橫斷面研究中發(fā)現長期暴露于濃度范圍較廣的PM與慢性腎臟病患病率增加之間存在顯著相關性，同時國外流行病學調查發(fā)現室外空氣污染與腎癌的發(fā)生密切相關，但既往研究皆是關于PM對肺臟健康影響的研究，并發(fā)現PM可致人正常肺上皮細胞中p38 蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38MAPK)在蛋白水平表達升高。

p38MAPK 是MAPKs 家族中的主要成員之一，應激原(如缺氧、熱休克、紫外線等)和炎性因子都可刺激其激活，通過磷酸化MAPK中的蘇氨酸和酪氨酸殘基而活化MAPK，導致細胞增生、分化、凋亡、壞死等。腎小管細胞的凋亡與p38MAPK 蛋白有著密切的聯系，p38MAPK 與急性腎損傷、糖尿病腎臟病、狼瘡性腎炎、多囊腎、終末期腎臟病等疾病的發(fā)生發(fā)展存在關聯。因此本文利用基因沉默技術構建

p38MAPK

基因沉默 HK-2 細胞，探討

p38MAPK

基因對PM染毒HK-2細胞后部分癌基因和凋亡相關基因表達的影響，為深入研究

p38MAPK

基因在PM致HK-2腎細胞損傷的毒理學機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內切酶

Eco

R Ⅰ、

Bam

H Ⅰ和

Kpn

Ⅰ購于美國Thermo Scientific 公司；T4 DNA ligase 購于NEB公司；質粒小提取試劑盒購于美國OMEGA Bio-Tek公司；RNeasy Mini Kit 購于德國QIAGEN 公司；PrimeScriptRT Reagent Kit、 SYBR Primescript RTPCR Kit 和真核表達載體 PLVX-shRNA2-puro 購于日本TaKaRa 公司；

J107

大腸桿菌感受態(tài)購于Biocan生物公司；包裝輔助質粒PLVX-GFP和慢病毒包裝試劑盒購于日本Clontech 公司；HK-2 細胞購于中國上海細胞庫，0.25% Trpsin-EDTA、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco 公司；RNeasy Mini Kit購于德國Qiagen公司，目的基因PCR引物由上海生工合成；p38MAPK 兔抗人單克隆抗體(#8690S)和c-myc兔抗人單克隆抗體(#9402)購于美國Cell Signaling 公司；Caspase-8 鼠抗人單克隆抗體(sc-81656)、Bcl-2鼠抗人單克隆抗體(sc-7382)和GAPDH 鼠抗人單克隆抗體(sc-365062)均購于美國Santa Cruz公司；二抗(羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP)購于美國Thermo Scientific公司。

1.2 PM2.5樣品采集與制備

用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm 直徑的石英濾膜，按100 L/min 的流量連續(xù)采樣，每天采樣24 h，連續(xù)采3 d，采樣地點位于太原山西大學校園。本實驗對采集到吸附有PM的濾膜稱取質量，后剪為2 cm×2 cm小片放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，使用錫箔紙封口，超聲振蕩30 min 后取出濾膜，將PM樣品懸濁液轉移至干凈的真空冷凍物料盤中，再次用錫箔紙將物料盤密封后置于-80 ℃冰箱冷凍24 h；用封口膜替換錫箔紙密封物料盤并在封口膜上點出密集小孔，于真空冷凍干燥機中干燥24 h，至PM完全干燥；無菌工作臺中紫外燈滅菌2 h后用超純水溶解干燥的PM顆粒，混合均勻后完成PM混懸液的制備，分裝標記后于-20 ℃保存待用，每次使用前振蕩混勻。

1.3 設計合成shRNA

在NCBI 查找

p38MAPK

的全序列，設計干擾序列，將干擾序列打亂并進行隨機突變得到陰性對照序列，委托生工合成

p38MAPK

-shRNA和陰性對照序列shRNAc，見表1。

表1 shRNA干擾引物序列

1.4 p38MAPK基因沉默病毒載體的構建與包裝

利用

Eco

RⅠ和

Bam

HⅠ對載體pLVX-shRNA1 進行雙酶切，37 ℃酶切30 min 后，再次添加限制性內切酶37 ℃酶切30 min。將酶切后的載體進行瓊脂糖凝膠電泳回收，按照體系添加試劑，混合均勻后放置于已煮沸的水中，待自然冷卻至室溫即退火完成后再加入1 mL ddHO。按照體系添加試劑使退火后得

p38MAPK

基因與酶切后pLVX-shRNA1 相連接，16 ℃連接過夜。將連接產物與感受態(tài)細胞混勻后冰浴 30 min，42 ℃熱激70 s，隨后立即置冰上放置2 min，加入預熱至室溫的150 μL TB 培養(yǎng)基，250 r/min，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)1 h，用移液器取100 μL均勻涂在含100 μg/mL 青霉素抗性的TB 平板上，倒置并于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。參考質粒小提試劑盒(Omega，D6950-02)說明書對陽性克隆子的質粒進行提取。將提取的質粒分別用

Eco

RⅠ和

Kpn

Ⅰ，

Bam

HⅠ和

Kpn

Ⅰ進行雙酶切，酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，將提取的質粒送往測序中心進行測序。將酶切鑒定片段正確的質粒送往上海生工進行測序鑒定。挑取測序正確的重組載體，通過Lipofecatmin 2000分別瞬時轉染到HK-2細胞中，培養(yǎng)24 h后，進行熒光定量PCR，檢測

p38MAPK

基因的表達水平變化，選取干擾效率最高的載體(pLVX-C-MYC-shRNA2)進行慢病毒的包裝。按照Lenti-XLentiviral Expression Systems 試劑盒說明書步驟將pLVX-

p38MAPK

-shRNA2 包裝慢病毒，在37 ℃，CO體積分數為5%條件下大量培養(yǎng)細胞，消化細胞進行鋪板，待細胞的融合率在90%時將轉染試劑、包裝質粒、目的質粒混合均勻滴入培養(yǎng)皿中進行轉染，收集上清培養(yǎng)基，超速離心并過濾以純化濃縮慢病毒，檢測過濾好的病毒滴度。

1.5 慢病毒轉染HK-2細胞

對HK-2 細胞進行有效Puromycin 篩選濃度檢測，按照每孔1×10個細胞的濃度將HK-2細胞接種到6孔板，在37 ℃，CO體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每孔分別加入 0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 μg/mL 嘌呤霉素對正常HK-2細胞進行篩選預實驗，隨后使用篩選的濃度對轉導慢病毒后的HK-2細胞進行篩選。將HK-2細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)18 h后待細胞匯合度達到50%時，加入10 μL 的病毒上清，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)24 h，隨后在熒光倒置顯微鏡下觀察HK-2 細胞感染帶有綠色熒光蛋白標簽的病毒感染效果，換用1 μg/mL 嘌呤霉素對細胞進行篩選，每隔2 d 換液一次，篩選時間為7 d，篩選完成后，去除培養(yǎng)瓶中含嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，加入正常的完全培養(yǎng)基使細胞正常生長。

1.6 p38MAPK基因沉默細胞株鑒定

1.6.1 實時熒光定量PCR 檢測 基因表達水平

將HK-2細胞和

p38MAPK

基因沉默細胞接種至6 孔板，待細胞底面覆蓋率達到80%～90%時，用RNeasy Mini Kit 提取細胞總RNA，用Prime Script RT Reagent Kit 將總RNA 反轉錄為cDNA。取2 種細胞的cDNA 各1 μL 為模板進行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)，檢測

p38MAPK

基因表達水平的變化，PCR引物委托上海生工公司合成，引物序列見表2。

表2 p38MAPK基因和內參基因PCR引物

1.6.2 Western blot 檢測p38MAPK 蛋白表達水平

取HK-2 細胞和

p38MAPK

基因沉默細胞各1 瓶(25 cm細胞培養(yǎng)瓶)，棄培養(yǎng)基并用PBS 洗3 次，加入200 μL IP細胞裂解液裂解30 min，將裂解的細胞快速從瓶壁刮下，收集蛋白后于4 ℃離心30 min，12 000 r/min，加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，100 ℃變性8 min。配制10%分離膠，5%濃縮膠，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉法90 min 將蛋白完全轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別使用p38MAPK抗體和GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3 次，每次10 min，再加入二抗于室溫孵育1 h，TBST 洗膜 3 次，每次 10 min，加入 Western blot化學發(fā)光試劑后在冷CCD成像系統(tǒng)中進行顯影，所得圖像利用ImageJ軟件進行條帶灰度定量分析。

1.7 PM2.5染毒正常 HK-2 細胞和p38MAPK 基因沉默HK-2細胞

使用DMEM 完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37 ℃、CO體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細胞和基因沉默細胞，根據前期CCK-8 試驗得到PM染毒的IC為95.98 μg/mL，本實驗設定PM的染毒劑量為50 μg/mL，以不含血清和PM的DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對照。細胞分為4 組：未染毒正常腎細胞、未染毒

p38MAPK

基因沉默細胞、PM染毒正常腎細胞和PM染毒

p38MAPK

基因沉默細胞，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定且匯合度達80%時進行染毒，在37 ℃、CO體積分數為5%條件下染毒培養(yǎng)24 h后檢測癌基因與凋亡相關基因的mRNA和蛋白表達水平。

1.8 目的基因mRNA和蛋白水平表達情況檢測

1.8.1 熒光定量PCR 檢測目的基因mRNA 表達水平

染毒24 h后，按照1.6.1的方法提取RNA，將RNA 反轉錄為cDNA，按照說明書配置qPCR反應體系，檢測癌基因(

c-myc

、

c-fos

、

p53

)和凋亡相關基因(

Caspase-8

、

Caspase-9

、

Bcl-2

)的相對表達量，目的基因的引物均委托上海生工公司合成，引物序列見表3。

表3 癌基因和凋亡相關基因PCR引物

1.8.2 Western blot 檢測目的蛋白表達水平

染毒24 h 后的細胞按照方法1.6.2 提取總蛋白并進行定量，SDS-PAGE 凝膠電泳后，按200 mA的電流濕轉90 min，再用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據目的蛋白相對分子質量大小，切取膜上相應條帶，按說明書上的比例加入相應的一抗后冰上孵育過夜；1×TBST洗膜3 次，每次10 min。按1∶3 000 的比例稀釋HPR標記的羊抗鼠二抗、HPR標記的羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h；1×TBST洗膜3次，每次10 min。加入化學發(fā)光試劑后用冷CCD 成像系統(tǒng)對其進行曝光拍照，所得圖像用ImageJ軟件進行條帶灰度定量分析。

1.9 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 p38MAPK基因沉默細胞的鑒定

qPCR 檢測結果見圖1，與正常HK-2 細胞相比，

p38MAPK

基因沉默 HK-2 細胞中 p38MAPK mRNA 表達下降58.50%，差異有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.01)。Western blot 檢測結果見圖2，與正常HK-2 細胞比較，

p38MAPK

基因沉默 HK-2 細胞中

p38MAPK

蛋白表達下降了51.33%，差異有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.01)。

圖1 熒光定量PCR檢測結果

圖2 Western blot檢測結果

2.2 PM2.5染毒后HK-2 細胞凋亡相關基因和癌基因mRNA表達水平變化

圖3 PM2.5染毒兩種細胞24 h后部分凋亡相關基因和癌基因mRNA表達水平變化

qPCR 實驗結果見圖3，用濃度為50 mg/mL 的PM混懸液對HK-2 細胞和

p38MAPK

基因沉默HK-2細胞染毒24 h 后，與對照組HK-2 細胞比較，PM染 毒 HK-2 細 胞 組 中 c-myc、 c-fos、 Caspase-8 和Casepase-9 mRNA 表達分別升高39.89%、15.12%、19.47%和15.45%，p53 和Bcl-2 mRNA 表達分別下降21.54%和31.77%，差異均具有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.05)。與PM染毒HK-2細胞組比較，PM染毒

p38MAPK

基因沉默HK-2細胞中c-myc、c-fos、p53、Caspase-8和Caspase-9 mRNA 表達分別下降了84.55%、63.55%、34.49%、37.19%和54.97%，差異均具有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.05)；Bcl-2 mRNA的表達水平無明顯變化。

2.3 PM2.5染毒后凋亡相關基因和癌基因的蛋白表達水平變化

Western blot 實驗結果見圖4 和圖5，用濃度為50 mg/mL 的PM染毒24 h后，與對照組HK-2細胞相比，PM染毒HK-2細胞組中c-myc和Caspase-8蛋白表達分別升高19.55%和12.74%，Bcl-2蛋白表達下降17.82%，差異均具有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.05)；與PM染毒組HK-2細胞相比，PM染毒

p38MAPK

基因沉默組HK-2細胞中c-myc和Caspase-8蛋白的表達分別下降47.16%和32.08%，差異均具有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.01)。

圖4 PM2.5 染毒HK-2 細胞和p38MAPK 基因沉默細胞后c-myc、Caspase-8和Bcl-2蛋白表達水平

圖5 PM2.5染毒兩種細胞后部分凋亡相關基因和癌基因的蛋白表達水平變化

3 討 論

腫瘤細胞的生物學過程是癌癥發(fā)生的標志，包括增殖、分化、侵襲和遷移。課題組前期研究已經得到PM可以導致肝細胞中癌基因在mRNA或蛋白質水平表達的增加，本次試驗結果得到PM染毒后正常HK-2細胞中的

c-myc

和

c-fos

基因相對于未染毒正常HK-2 細胞中表達增加，

p53

基因表達下降，更有力地說明PM可以影響細胞中癌基因的表達。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)被證實是調節(jié)腫瘤細胞生物學過程中至關重要的信號通路，MAPK信號通路與卵巢癌、肝癌、人口腔鱗狀細胞癌等的發(fā)生、發(fā)展關系密切。鄒寒冰等發(fā)現HDW 可能通過抑制MAPK 通路相關蛋白來選擇性抑制腎癌細胞ACHN 的增殖，促進ACHN 細胞MET、周期阻滯和凋亡。有研究發(fā)現CEM-6T 細胞中p38MAPK 蛋白表達量隨PM染毒劑量增加而增加。還有研究利用PM染毒EA.HY926細胞后發(fā)現PM可以降低細胞的存活率，上調p38MAPK 蛋白的表達并降低SOD活性。本次研究結果發(fā)現，與PM染毒的正常HK-2細胞相比，PM染毒的

p38MAPK

沉默細胞中

c-myc

和

c-fos

基因表達明顯下降(

P

＜0.01)，說明

p38MAPK

基因對PM致HK-2細胞中的癌基因活化有一定的抑制作用，國內外學者的研究亦得到當p38MAPK 信號通路激活時c-myc 顯著上調。不同于癌基因

c-myc

和

c-fos

的表達，抑癌基因

p53

在PM染毒的

p38MAPK

基因沉默細胞中表達下降，并未表現出

p38MAPK

基因沉默之后對抑癌基因

p53

活化有明顯的促進作用，這可能與PM通過激活P53以上調DRAM1 的表達誘導細胞發(fā)生自噬有關，提示PM可能也具有導致腎細胞發(fā)生自噬的作用。張良等將馬兜鈴酸 I(aristolochic acid I，AAI)作用于SD雄性大鼠，發(fā)現總p38(t-p38)、磷酸化p38(pp38)蛋白、Caspase-3、Caspase-9、Bax等凋亡相關蛋白的表達水平均升高，腎組織中凋亡小體明顯增多，AAI 可能通過激活p38MAKP 通路導致腎臟組織細胞凋亡而產生腎毒性效應。在萬強等的研究中發(fā)現與對照組比較，PM染毒可以上調p-p38 MAPK蛋白水平及Bax/Bcl-2 蛋白比率以促進細胞凋亡。馮正平等為探討p38絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)在高糖誘導的MC3T3-E1 成骨細胞凋亡中的作用，對

p38MAPK

基因進行沉默，發(fā)現p38MAPK 信號通路的活化受到抑制，p-p38MAPK、Caspase-3、Bax的表達降低，Bcl-2 表達上調，抑制高糖所誘導的MC3T3-E1 成骨細胞的凋亡，說明PM可能通過調節(jié)凋亡相關蛋白表達以及調控MAPK信號通路從而影響細胞凋亡。本次實驗結果顯示，正常細胞經過PM染毒后

Caspase-8

和

Caspase-9

基因的表達水平均上調，

Bcl-2

表達下降，與前述研究結果相一致。與PM染毒的正常HK-2細胞相比，PM染毒的

p38MAPK

沉默細胞中

Caspase-8

和

Caspase-9

基因的表達均明顯下降，進一步說明了

p38MAPK

基因對PM染毒致凋亡基因活化具有抑制作用，

Bcl-2

基因則表達增加，說明

p38MAPK

基因也可以對PM染毒致抑凋亡基因活化起一定的促進作用

。

本文分別將正常HK-2細胞染毒前后與

p38MAPK

基因沉默細胞染毒后的癌基因和凋亡相關基因的表達進行比較，發(fā)現PM可引起正常HK-2細胞部分癌基因和凋亡相關基因表達水平升高；

p38MAPK

基因沉默細胞經過PM染毒后，癌基因和凋亡基因表達水平較正常細胞染毒后下降，說明

p38MAPK

基因在PM對凋亡相關基因和癌基因的活化過程中有一定的作用。本文建立的

p38MAPK

基因沉默HK-2細胞，為進一步研究MAPK信號通路在PM致細胞損傷作用的機制研究奠定了基礎。