劉春燕，張愛華

(貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

p53 作為細(xì)胞生命活動(dòng)中重要的監(jiān)視基因之一，在細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)、氧化應(yīng)激、自噬、衰老及凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的調(diào)控作用，p53 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與其翻譯后修飾有著緊密聯(lián)系。砷作為自然界中廣泛存在的有毒類金屬元素，人體長(zhǎng)期暴露于砷污染的飲水、空氣及食物所引起的砷中毒可致皮膚、肝、腎、肺等多器官損傷，因其健康損傷嚴(yán)重，加之致病機(jī)制不明和無特效治療藥物，成為制約砷中毒致人體多器官損傷防治的瓶頸，故研究砷毒性機(jī)制對(duì)尋找砷中毒致人體多器官損傷的治療藥物具有重要意義。近年來有關(guān)砷毒性機(jī)制的體內(nèi)外研究表明，p53 突變、轉(zhuǎn)錄活性、穩(wěn)定性、胞內(nèi)定位等在砷毒性機(jī)制中具有重要的作用，而p53在砷毒性機(jī)制中發(fā)揮的調(diào)控作用與其受到泛素化、磷酸化、乙?；?、甲基化等多種翻譯后修飾密切相關(guān)。因此，本文對(duì)p53的翻譯后修飾及其與砷中毒致人體多器官損傷的關(guān)系進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)p53在砷中毒致人體多器官損傷中的作用和作為潛在治療靶點(diǎn)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 p53的修飾與功能

大量研究證實(shí)，p53 在響應(yīng)多種脅迫應(yīng)激反應(yīng)中可表現(xiàn)出不同的功能，而p53 呈現(xiàn)功能的多樣性與p53 受到泛素化、磷酸化、乙?；?、甲基化等多種翻譯后修飾密切相關(guān)，這些修飾對(duì)p53穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性、胞內(nèi)定位、突變等具有重要的調(diào)節(jié)作用。

1.1 泛素化修飾對(duì)p53功能的調(diào)節(jié)

泛素化修飾指一個(gè)或多個(gè)泛素分子在一系列泛素酶的作用下與底物蛋白共價(jià)結(jié)合的一種蛋白翻譯后修飾過程，泛素化修飾后的底物蛋白可通過蛋白酶體等途徑降解，該修飾是調(diào)控蛋白表達(dá)水平及活性的重要機(jī)制。鼠雙微基因2(murine double minute，MDM2)是調(diào)控p53功能的一個(gè)重要E3泛素酶，研究顯示，MDM2 通過直接結(jié)合p53 轉(zhuǎn)錄激活區(qū)并將其單泛素化或多泛素化致p53 失活是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化較典型的事件之一，50%～60%的癌癥與p53 失活有關(guān)。應(yīng)激信號(hào)通過激活p53 介導(dǎo)MDM2 表達(dá)增加，反過來，增加的MDM2 負(fù)調(diào)節(jié)p53 活性，使得細(xì)胞不至于因過高活性的p53 而引起損傷，然而，MDM2 對(duì)基礎(chǔ)水平p53的維持有利于生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡。除經(jīng)典的p53-MDM2 反饋環(huán)外，含有RING-finger 結(jié)構(gòu)域的E3 泛素樣酶可與p53 相互作用并誘導(dǎo)其多泛素化，進(jìn)而促進(jìn)如胃癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，然而，另有研究顯示，泛素樣酶MSL2(male-specific lethal-2)對(duì)p53 K351和K357的泛素化修飾并不影響其降解，但與胞漿定位密切相關(guān)。不同條件下，p53泛素化修飾的差異調(diào)節(jié)還有待進(jìn)一步研究，其中常見的p53泛素化修飾位點(diǎn)如圖1所示。

1.2 磷酸化修飾對(duì)p53功能的調(diào)節(jié)

圖1 p53常見的翻譯后修飾類型及修飾位點(diǎn)

磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白氨基酸殘基或者在相關(guān)信號(hào)作用下結(jié)合GTP的過程，對(duì)蛋白活力具有重要的調(diào)節(jié)作用。磷酸化修飾作為研究較多的p53修飾類型與p53轉(zhuǎn)錄活性、穩(wěn)定性、細(xì)胞器定位及構(gòu)象等密切相關(guān)。p53 磷酸化位點(diǎn)橫跨整個(gè)結(jié)構(gòu)域，常見的磷酸化修飾位點(diǎn)如圖1 所示，其中p53 絲氨酸(serine，Ser)是研究較多的磷酸化修飾類型，p53 Ser15、p53 Ser20(小鼠p53Ser18、p53Ser23)被共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變(ataxia telangiectasia-mutated，ATM)激酶和檢查點(diǎn)激酶1/2(checkpoint kinase 1/2，Chk1/2)磷酸化以保護(hù)p53 免受主要負(fù)調(diào)節(jié)因子MDM2 的降解，進(jìn)而增強(qiáng)其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，這一機(jī)制在p53 Ser18 突變型小鼠的胸腺和脾細(xì)胞及p53 Ser23 突變型小鼠的胸腺細(xì)胞和發(fā)育的小腦中得到驗(yàn)證。酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TK)引起的級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)介導(dǎo)的p53 Ser6、p53 Ser9 的磷酸化可致p53與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路相互串?dāng)_，共同調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生過程中相關(guān)基因的表達(dá)。周期素依賴蛋白激酶5(cyclin dependent kinase 5，CDK5)對(duì)p53 Ser15、p53 Ser33、p53 Ser46 的磷酸化修飾通過增強(qiáng)p53 的轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡。蘇氨酸(threonine，Thr)155 的磷酸化修飾是Jun 激活區(qū)域連接蛋白1(c-Jun activation domain-binding protein1，Jab1)介導(dǎo) p53 核輸出的重要因素。目前，盡管DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中磷酸化修飾位點(diǎn)對(duì)p53 功能調(diào)節(jié)的研究有限，但有研究表明此區(qū)域是ChK1/ChK2等激酶的停泊位點(diǎn)，有助于p53 Ser20等其他位點(diǎn)的磷酸化修飾。p53 C 端(Ser315，Ser376，Ser392)磷酸化修飾的作用在于使p53 蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，以致p53 從“潛伏”狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫邆銬NA結(jié)合能力的活性狀態(tài)。

1.3 乙?；揎棇?duì)p53功能的調(diào)節(jié)

乙酰化修飾指在酶(或非酶)的作用下將乙酰輔酶A 的乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白氨基酸殘基上的過程，是一種可逆的蛋白翻譯后修飾。乙酰化修飾通過改變賴氨酸殘基上的電荷及蛋白構(gòu)象，從而影響蛋白活性、DNA 結(jié)合親和力和蛋白穩(wěn)定性等。p53 有多個(gè)可發(fā)生乙?；揎椀奈稽c(diǎn)，其主要的乙?；揎椢稽c(diǎn)如圖1 所示。DNA 結(jié)合域和C 末端域的乙?；揎椃乐筽53被泛素化降解，對(duì)增加p53 穩(wěn)定性、促進(jìn)p53 與靶基因結(jié)合增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性以及維持p53穩(wěn)定性等功能具有重要作用。p53作為轉(zhuǎn)錄因子通常需一系列轉(zhuǎn)錄共激活因子或轉(zhuǎn)錄共抑制因子的協(xié)助參與調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，p53 C端的乙?；揎椡ㄟ^招募轉(zhuǎn)錄共激活因子或轉(zhuǎn)錄共抑制因子是調(diào)控p53轉(zhuǎn)錄活性及下游靶基因表達(dá)的重要因素。體外研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶SET 作為p53 的轉(zhuǎn)錄共抑制因子，應(yīng)激誘導(dǎo)p53 C端乙?；降纳呖娠@著抑制p53-SET的相互作用及SET在p53 下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)的富集進(jìn)而促進(jìn)p53 轉(zhuǎn)錄活性，且p53 C 端的乙?；揎棇?duì)p53-SET 相互作用的抑制在

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基因敲入小鼠模型中也得到驗(yàn)證，此體內(nèi)外結(jié)果對(duì)開發(fā)針對(duì)該機(jī)制的藥物研究具有重要意義。

1.4 甲基化修飾對(duì)p53功能的調(diào)節(jié)

甲基化修飾指從活性甲基化合物上將甲基經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)移到其他化合物進(jìn)而形成各種甲基化產(chǎn)物。蛋白質(zhì)甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化，蛋白甲基化可調(diào)控蛋白-蛋白相互作用、蛋白-DNA或蛋白-RNA相互作用、蛋白穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位或轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，SET7/9 可誘導(dǎo)p53 K372甲基化修飾，此修飾可穩(wěn)定p53并使其滯留在細(xì)胞核，參與調(diào)節(jié)p21 等靶基因的轉(zhuǎn)錄，然而，也有研究顯示，SET8 對(duì)p53 K382 的單甲基化及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)對(duì)p53 K370的甲基化可衰減p53與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，相反，賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶PHF20(plant homeodomain finger 20)介導(dǎo)的p53 K370或K382 二甲基化可增強(qiáng)p53 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。除賴氨酸甲基化外，p53 上的精氨酸也可發(fā)生甲基化，蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶 5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)對(duì) p53 及p53 結(jié)合蛋白的甲基化修飾參與調(diào)控p53 與靶基因的特異性結(jié)合。p53主要的甲基化修飾位點(diǎn)如圖1所示。

1.5 修飾的串?dāng)_對(duì)p53功能的調(diào)節(jié)

如上所述，p53 有眾多可被修飾的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的修飾可調(diào)節(jié)p53 穩(wěn)定性、胞內(nèi)定位及轉(zhuǎn)錄活性等功能。有趣的是，與p53 Ser18 或p53 Ser23 突變型小鼠的胸腺細(xì)胞、脾細(xì)胞相比，p53 Ser18 或p53 Ser23 突變型小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞其p53依賴的細(xì)胞周期阻滯和p53穩(wěn)定性并不受γ射線、電離輻射刺激的影響，此體內(nèi)外結(jié)果的差異提示，在特定刺激或不同靶器官中，不可否認(rèn)p53 Ser15、p53 Ser20(小鼠p53 Ser18、p53 Ser23)磷酸化修飾可增加p53穩(wěn)定性，但對(duì)于體內(nèi)p53穩(wěn)定性的調(diào)控可能存在一個(gè)更為復(fù)雜而精細(xì)的作用網(wǎng)絡(luò)，而不是靠單一的磷酸化修飾就可完成。p53 Ser15、p53 Thr18、p53 Ser120和p53 Ser137磷酸化的結(jié)合可通過招募CBP/p300增加p53的乙?；揎椝?，進(jìn)而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，相反，泛素樣酶E4F1(E4 transcription factor 1)和賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶PCAF(P300/CBP-associated factor)可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合p53 K320，且E4F1 對(duì)p53 K320 的泛素化可緩解PCAF 對(duì)K320 的乙?；饔?，進(jìn)而阻斷p53 的轉(zhuǎn)錄活性。N-乙酰轉(zhuǎn)移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)不僅乙?；痯53 K120 還泛素化p53 負(fù)調(diào)節(jié)因子MDM2，協(xié)同增強(qiáng)p53 穩(wěn)定性，且p53 的乙?；勺钄郤ET 對(duì)其甲基化的調(diào)控，另有研究發(fā)現(xiàn)，SET7/9 對(duì)p53 K372 的甲基化修飾導(dǎo)致其乙?；皆黾訉?duì)調(diào)節(jié)p53 穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要。這些研究表明，各位點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)多種不同的修飾，各種修飾之間的交互作用可能是p53執(zhí)行功能的決定性因素，可將這些串?dāng)_分為6 大類：同種修飾相互作用、鄰近修飾相互作用、協(xié)同修飾相互作用、異種修飾相互作用、遠(yuǎn)端修飾相互作用、拮抗修飾相互作用。

2 p53 的翻譯后修飾與砷中毒致人體多器官損傷的關(guān)系

p53 的表達(dá)及活性受到磷酸化、乙酰化、甲基化及泛素化等多種翻譯后修飾的共同作用。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者以細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，并充分結(jié)合有限的人群樣本對(duì)有關(guān)p53翻譯后修飾在砷中毒致人體多器官損傷中的作用進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，砷中毒對(duì)p53 翻譯后修飾的調(diào)節(jié)致p53 轉(zhuǎn)錄活性、細(xì)胞定位、穩(wěn)定性的改變參與了砷中毒致人體多器官損傷進(jìn)程，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn) ， 1 μmol/L NaAsO可 降 低 p53 Ser15、 p53 Ser46、 p53 Ser392磷酸化水平和p53 K382乙酰化水平，p53磷酸化及乙酰化修飾水平的降低通過削弱p53與DNA的結(jié)合能力并抑制下游靶基因的表達(dá)進(jìn)而促使人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)惡性轉(zhuǎn)化，另10 μmol/L NaAsO致人乳腺上皮細(xì)胞(MCF-10A)惡性轉(zhuǎn)化與誘導(dǎo)MDM2 表達(dá)增加和p53 Ser15 磷酸化水平降低有關(guān)。p53的翻譯后修飾除參與砷中毒致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化外，也可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致器官損傷，研究發(fā)現(xiàn)，砷中毒可通過增加大鼠肝組織中p53 Ser20 磷酸化水平及其介導(dǎo)的線粒體凋亡通路致肝細(xì)胞凋亡，體外研究顯示，10 μmol/L NaAsO誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)及HaCaT 細(xì)胞凋亡，其凋亡機(jī)制與促進(jìn)p53核移位、增加p53穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性等功能有關(guān)，且最近的一項(xiàng)證據(jù)表明，高劑量砷不僅增加p53 熱力學(xué)穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性，甚至對(duì)發(fā)生結(jié)構(gòu)型突變的p53仍能保持三級(jí)結(jié)構(gòu)以及抑癌功能活性。盡管p53的翻譯后修飾對(duì)p53功能的調(diào)節(jié)在砷中毒多器官損傷中的作用機(jī)制尚不完全清楚，但已發(fā)現(xiàn)砷對(duì)p53翻譯后修飾的調(diào)控與p53 功能有著緊密聯(lián)系，而p53 功能的變化決定了砷通過誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致機(jī)體癌變還是通過誘導(dǎo)細(xì)胞異常凋亡進(jìn)而參與機(jī)體損傷。在燃煤型砷中毒患者皮膚損傷中發(fā)現(xiàn)，p53 陽(yáng)性表達(dá)率與燃煤型砷中毒患者皮膚損傷的臨床分級(jí)和病理分型相關(guān)，但也發(fā)現(xiàn)燃煤砷中毒可致人體外周血

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基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化、第5外顯子低甲基化和突變。對(duì)來自西孟加拉邦高砷污染地區(qū)的162名角化病患者發(fā)現(xiàn)，砷中毒相關(guān)的器官損傷(周圍神經(jīng)病變、結(jié)膜炎和呼吸系統(tǒng)疾病)和遺傳損傷與p53第72位精氨酸突變有關(guān)。這些研究從多層面揭示了p53在砷中毒多器官損傷中的作用復(fù)雜，結(jié)合體內(nèi)外機(jī)制研究推測(cè)，這可能與p53 翻譯后修飾的復(fù)雜性及不同砷濃度有關(guān)。

3 展 望

綜上所述，p53 存在著多種翻譯后修飾，其翻譯后修飾的多樣性、復(fù)雜性及可逆性決定了量化p53功能的困難性，研究者需要根據(jù)自己的研究背景，抽絲剝繭，分清主次，找出砷致機(jī)體損傷中p53的動(dòng)態(tài)變化形式及占主導(dǎo)地位的修飾類型，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。另在砷毒性刺激下，p53 與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有著怎樣的交互聯(lián)系？對(duì)其深入研究，將補(bǔ)充砷中毒致人體多器官損傷等復(fù)雜性疾病致病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。鑒于p53翻譯后修飾及介導(dǎo)p53功能的變化參與了砷中毒多器官損傷進(jìn)程，因此，靶向p53相關(guān)修飾位點(diǎn)或修飾酶可能是預(yù)防和治療砷中毒致多器官損傷的又一選擇。在過去十幾年里，盡管靶向MDM2-p53反饋環(huán)的小分子藥物研發(fā)遭遇了挫折，但隨著結(jié)合肽類、靶向降解劑以及mRNA療法的不斷發(fā)展，給p53-MDM2的藥物研發(fā)帶來新機(jī)遇，目前處于臨床階段的MDM2抑制劑如ALRN-6924、BI907282、Idasanutlin 等備受關(guān)注。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用天然植物藥進(jìn)行砷中毒防治探索發(fā)現(xiàn)，刺梨制劑、銀杏制劑、姜黃素等天然植物藥對(duì)砷中毒引起的肝、腎、神經(jīng)毒性及免疫失衡的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、自噬、炎性反應(yīng)等密切相關(guān)。鑒于這些信號(hào)與p53之間的緊密聯(lián)系，探討相應(yīng)天然植物藥對(duì)p53翻譯后修飾及功能的調(diào)節(jié)對(duì)開發(fā)砷中毒多器官損傷治療藥物具有重要意義。