方 磊，楊 濤，盛 磊，木塔力甫·艾買提，齊鑫鑫，艾尼娃爾·艾克木，*，伊力亞爾·尼加提，*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

宮頸癌是全球發(fā)病率第4 的婦科惡性腫瘤，每年有超過100萬婦女被診斷患有宮頸癌，并有30多萬人因此死亡，宮頸癌對全球女性生命健康造成巨大威脅。在宮頸癌治療方面，放射治療、化學藥物治療和手術治療仍是主要治療手段，這些治療方法雖能在一定程度上改善臨床癥狀，提高患者預后生存率，但會影響患者的免疫功能導致并發(fā)癥。因此尋找更安全有效的治療手段對改善宮頸癌患者生命質(zhì)量具有重大意義。

傳統(tǒng)中藥可通過多成分、多靶點和多途徑聯(lián)合作用于腫瘤細胞增殖和周期進程，調(diào)節(jié)細胞信號傳導通路，影響相關蛋白轉(zhuǎn)錄及細胞因子進而發(fā)揮抗宮頸癌作用。黑種草子為瘤果黑種草(

Nigella glandulifera

Freyn)的干燥成熟種子，是一種藥食同源的藥材，在我國新疆地區(qū)有著悠久的藥用和食用歷史?，F(xiàn)代研究表明，黑種草子中富含皂苷、黃酮和生物堿等，具有廣泛的藥理活性。在抗腫瘤作用方面，黑種草子皂苷類單體Nigella A、總黃酮及酚酸類物質(zhì)都表現(xiàn)出良好效果。

細胞自噬是細胞通過降解胞內(nèi)損壞的細胞器及蛋白質(zhì)等，以進行細胞自身代謝和更新，實現(xiàn)細胞自身物質(zhì)循環(huán)利用的過程。研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個過程，腫瘤細胞可通過自噬維持自身環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在各種惡劣生長環(huán)境下生存。然而長時間高水平的自噬則會失去對細胞的保護作用，導致細胞死亡。因此尋找針對細胞自噬途徑的治療靶點，可能建立新的腫瘤治療方法。

本研究在黑種草子總皂苷(total saponins from the seeds of

Nigella glandulifera

Freyn，TSNG)對人宮頸癌SiHa細胞體外增殖活性及遷移抑制作用的研究基礎上，擬探討TSNG對SiHa細胞凋亡及自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

人宮頸癌SiHa細胞株，由新疆醫(yī)科大學地方病重點實驗室惠贈；黑種草子，購自新疆麥迪森有限公司，經(jīng)質(zhì)檢鑒定符合藥典規(guī)定；胎牛血清，購自美國Gibco 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶，均購自天津灝洋生物公司；噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)，購自美國MP biomedical 公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，購自美國BIO FROXX 公司；凋亡檢測試劑盒，購自美國BD 公司；Hoechst33342 試劑盒、單丹磺酰戊二胺(monodansyl cadaverine，MDC)試劑盒，均購自北京索萊寶公司；硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)，購自上海源葉公司；抗LC3B、抗p62 抗體均購自美國Abcam 公司；抗β-actin抗體，購自affinity公司。

1.2 儀器設備

本研究使用的主要儀器有：低溫高速離心機(美國Beckman Coulter 公司)；MLS-3020U 高壓滅菌鍋(日本Snayo 公 司)； 倒 置 熒 光 顯 微 鏡(德 國 Leica 公 司)；Thermo Multiskan GO 全波長酶標儀(美國 Thermo 公司)；流式細胞儀(美國BD 公司)；激光共聚焦顯微鏡(日 本 Nikon 公 司)； 電 泳 儀 (美 國 Bio-Rad 公 司)；FluorChem E 化學發(fā)光凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)。

1.3 TSNG制備

黑種草子粉碎，以固液比1∶10 加入30%乙醇70 ℃回流提取3 次，每次1 h，合并提取液，旋蒸濃縮后經(jīng)AB-8 大孔樹脂純化后得TSNG，以香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測定總皂苷質(zhì)量分數(shù)為39.2%。

1.4 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌SiHa細胞復蘇后，使用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于CO體積分數(shù)為5%的37 ℃培養(yǎng)箱中。待細胞生長至匯合度為80%～90%時，對細胞進行傳代培養(yǎng)。

1.5 MTT實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于96 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。根據(jù)課題組前期預實驗結果，設置TSNG 系列濃度(0、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL)，作用24 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 200 μL后于酶標儀檢測490 nm處各孔吸光度值

D

(490)，按下式計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率/%＝[

D

(490)-

D

(490)/

D

(490)]×100%

1.6 細胞形態(tài)觀察

取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。根據(jù)MTT 實驗所得IC，分別選擇IC的60%、70%、80%作為TSNG的作用濃度進行后期實驗。以不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG 作用 24 h 后分別在倒置顯微鏡下觀察細胞生長密度、形狀、體積等細胞形態(tài)特征，并拍照。

1.7 劃痕實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。待細胞生長至100%，用200 μL 槍頭在每孔中做3 條平行劃痕。PBS 洗凈漂浮細胞，于倒置顯微鏡下對各組劃痕拍照。再以含2%胎牛血清培養(yǎng)基配制不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG 作用 24 h 后使用倒置顯微鏡對劃痕拍照，使用ImageJ軟件計算各組劃痕面積

S

，并按下式計算細胞相對遷移率。相對遷移率=(

S

-

S

)/

S

1.8 細胞凋亡實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。鑒于流式細胞術Annexin V-FITC/PI 染色法是一種能準確定量檢測細胞凋亡率的手段，因此為更準確反映TSNG 對SiHa 細胞凋亡率的影響，本研究設置稍大作用濃度范圍，分別用0、1.0、1.2、1.4 mg/mL TSNG 作用24 h 后收集細胞。采用凋亡試劑盒進行染色，以流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.9 Hoechst和MDC染色實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于四格玻底皿，過夜培養(yǎng)貼壁。分別以不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG作用24 h后，使用Hoechst33342工作液37 ℃避光染色20 min 后，再以MDC 染色工作液室溫避光染色20 min。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)綠色熒光顆粒的熒光強度和數(shù)量，以判斷細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量。

1.10 蛋白免疫印跡實驗

取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔培養(yǎng)板，過夜培養(yǎng)貼壁。分別以不同濃度(0、0.9、1.0、1.1 mg/mL)TSNG 作用24 h。同時設置HCQ 干預組，使用自噬抑制劑HCQ(10 μmol/L)提前干預4 h 后再以TSNG(1.0 mg/mL)作用24 h。收集各組細胞并提取總蛋白。經(jīng)十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入抗LC3B 抗體(1∶3 000 稀釋)，抗 p62 抗體(1∶3 000 稀釋)，抗β-actin抗體(1∶3 000 稀釋)，4 ℃過夜孵育后，室溫孵育相應二抗1 h。ECL 化學發(fā)光顯影后，ImageJ 軟件分析蛋白條帶，蛋白表達水平以相對值表示。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 TSNG抑制SiHa細胞增殖

MTT實驗結果見表1。TSNG對SiHa細胞增殖具有抑制作用，且隨TSNG 作用濃度的增加，生長抑制率升高(

P

＜0.05)。使用SPSS 23.0 軟件對抑制率進行Probit回歸分析，計算得出其IC=1.322 mg/mL。

表1 MTT實驗檢測不同濃度TSNG作用后SiHa細胞的吸光度值和生長抑制率(n=3，)

2.2 TSNG對細胞形態(tài)的影響

形態(tài)觀察結果見圖1?？瞻讓φ战M細胞多呈梭形，形態(tài)飽滿，數(shù)量多，輪廓清晰。TSNG 作用后細胞密度明顯降低，細胞內(nèi)產(chǎn)生空泡，并且皺縮，破裂，死亡細胞逐漸增多。

2.3 TSNG抑制SiHa細胞遷移

劃痕實驗結果見圖2 和圖3。作用后24 h 后，空白組劃痕面積及距離明顯減小，TSNG 作用組隨著藥物濃度的增大，劃痕面積減小程度逐漸降低。使用ImageJ 軟件分析各組處理前后劃痕面積并計算相對遷移率，0.9、1.0、1.1 mg/mL TSNG 作用組細胞相對遷移率分別為(20.40±2.49)%、(15.14±0.39)%、(5.05±1.04)%，均低于空白對照組的(36.63±2.52)% (

P

＜0.01)。

2.4 TSNG對SiHa細胞凋亡影響

細胞凋亡率檢測實驗結果見圖4。不同濃度(1.0、1.2、1.4 mg/mL)TSNG 作用于SiHa 細胞后細胞凋亡率(Q2+Q4)分別為(39.10±0.22)%，(68.37±0.58)%和(80.93±0.12)%。與空白對照組的(10.73±0.82)%相比，差異均具有統(tǒng)計學意義(

P

＜0.01)。TSNG對SiHa細胞凋亡具有明顯誘導作用，特別是對早期凋亡影響顯著。

圖1 TSNG作用SiHa細胞后的形態(tài)觀察(×100)

圖2 TSNG作用SiHa細胞的劃痕實驗觀察結果(×50)

圖3 劃痕實驗檢測TSNG作用SiHa細胞后的相對遷移率

2.5 Hoechst和MDC染色結果

Hoechst33342 和MDC 染色共染結果見圖5。相較于空白對照組，隨著TSNG 作用濃度的增加，細胞核固縮、破裂，呈致密濃染細胞數(shù)量增多。同時細胞內(nèi)綠色熒光顆粒數(shù)量明顯增加，熒光強度增強。表明TSNG 能誘導細胞發(fā)生凋亡和引起細胞內(nèi)自噬體數(shù)量的增加。

2.6 TSNG對SiHa細胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表達影響

Western blot 實驗結果見圖6。與空白對照組相比，TSNG作用后SiHa細胞LC3-Ⅰ蛋白表達變化不明顯，但LC3-Ⅱ和p62蛋白表達量均有明顯上升(

P

＜0.05或0.01)。為進一步探究其可能的影響機制，使用HCQ合并TSNG 干預。相較于TSNG 作用組，HCQ 干預組LC3-Ⅱ和p62 蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義。結果表明TSNG 可能作用于自噬流后期，阻礙自噬體和溶酶體的融合。

圖4 流式細胞術檢測TSNG作用SiHa細胞后的細胞凋亡率

圖5 Hoechst和MDC染色觀察TSNG作用SiHa細胞后的熒光強度(×600)

3 討 論

傳統(tǒng)中藥可通過多途徑、多靶點發(fā)揮抗宮頸癌作用，且有并發(fā)癥少的優(yōu)勢，具有良好的臨床應用開發(fā)前景。皂苷類物質(zhì)作為中醫(yī)藥用植物中常見的活性物質(zhì)，可通過調(diào)控腫瘤細胞周期、誘導分化和促進凋亡等途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究實驗結果表明，TSNG 對SiHa 細胞增殖和遷移表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并呈劑量-效應關系。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，目的是調(diào)控發(fā)育、維護機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，是細胞的基本生命活動，對維持機體正常生理功能具有重要意義。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與凋亡相關蛋白p53、Bcl-2 和Bax 等的異常表達密切相關，同時宮頸癌傳統(tǒng)治療手段如放射治療和化學藥物治療等部分作用機制也與誘導凋亡有關。故而細胞凋亡途徑可作為宮頸癌治療潛在靶點。本研究采用流式細胞術檢測TSNG 作用后的SiHa細胞凋亡率，結果表明，TSNG 在體外可顯著誘導宮頸癌SiHa 細胞凋亡，尤其是對細胞早期凋亡影響顯著。同時經(jīng)凋亡特異性染料Hoechst33342 染色觀察，TSNG 干預后細胞出現(xiàn)細胞核固縮、破裂呈致密濃染等經(jīng)典凋亡現(xiàn)象，且藥物干預濃度越大，現(xiàn)象越明顯。

細胞凋亡和細胞自噬存在著多重聯(lián)系，二者常伴隨發(fā)生，既能相互抑制，也能相互促進。在腫瘤治療過程中，抗腫瘤藥物對腫瘤細胞生存產(chǎn)生壓力，細胞則會啟動自噬進行自我保護并抑制細胞凋亡。因此對細胞自噬與凋亡的相互作用研究，可能有助于尋找腫瘤治療新途徑。

圖6 Western blot實驗檢測細胞LC3-Ⅱ和p62蛋白表達

細胞自噬對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有復雜的調(diào)節(jié)作用，在腫瘤形成早期，自噬可維持基因組和染色體的穩(wěn)定從而抑制腫瘤的發(fā)生。但當腫瘤發(fā)展至一定階段，腫瘤細胞將面臨營養(yǎng)缺乏、缺氧的微環(huán)境改變，此時自噬可通過對細胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)再利用，維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，幫助腫瘤細胞生存。自噬調(diào)控主要是由自噬相關基因(autophagy-related genes，ATGs)編碼蛋白質(zhì)完成的，現(xiàn)階段常用于自噬水平檢測的蛋白標志物為LC3(microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3)和p62/SQSTM1(Sequestosome-1)等自噬相關蛋白。LC3 蛋白分為胞質(zhì)狀態(tài)Ⅰ型(LC3-Ⅰ)和膜結合狀態(tài)Ⅱ型(LC3-Ⅱ)，自噬發(fā)生時LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ存在于自噬前體和自噬體，隨自噬體膜的增多而表達量增加。因此，LC3-Ⅱ蛋白的表達水平與自噬體數(shù)量密切相關。在自噬發(fā)生過程中，自噬體的生成增加、成熟或自噬后期自噬體降解障礙均能導致LC3-Ⅱ蛋白表達水平的升高。p62 作為連接LC3 和泛素化底物的自噬受體蛋白，最終將被整合至自噬體中，隨后在自噬溶酶體中被酶解。通常情況下，當自噬流被阻斷時p62 不能被正常降解，導致p62 表達水平上升。本研究在檢測LC3-Ⅱ蛋白表達水平的基礎上，試圖通過檢測p62蛋白的表達水平來證明TSNG對細胞自噬流的影響。實驗結果表明，TSNG 作用后細胞LC3-Ⅱ和p62 蛋白表達水平均明顯上升，TSNG 可對細胞自噬造成影響。但LC3-Ⅱ和p62蛋白表達水平同時上調(diào)，并非自噬發(fā)生的常規(guī)現(xiàn)象。

為進一步研究，采用自噬抑制劑HCQ干預，進行LC3 蛋白 turnover 實驗。HCQ 作為常見自噬抑制劑，可作用于溶酶體蛋白酶干擾自噬體和溶酶體的融合以阻斷自噬流。實驗結果表明，HCQ 干預組與TSNG作用組的LC3-Ⅱ和p62蛋白相對表達水平未見明顯差異。同時MDC 染色實驗結果表明，TSNG 引起細胞內(nèi)自噬體數(shù)量增加。綜合以上實驗結果，推測TSNG 可能作用于自噬流后期，干擾自噬體和溶酶體的融合以阻斷自噬流造成自噬體降解障礙，從而導致LC3-Ⅱ和p62蛋白堆積。

綜上所述，本研究中TSNG 對SiHa 細胞的增殖、遷移表現(xiàn)出抑制作用，對SiHa細胞凋亡具有誘導作用并且可阻斷細胞自噬流。但其對SiHa細胞自噬的具體影響機制以及自噬與誘導凋亡間相互作用仍需進一步研究，以開發(fā)其抗宮頸癌臨床應用的潛在價值。